粒细胞样髓源性抑制细胞自噬对小鼠Lewis肺癌移植瘤发展的影响

发布时间：2017-04-06 01:05

  本文关键词：粒细胞样髓源性抑制细胞自噬对小鼠Lewis肺癌移植瘤发展的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的观察Lewis lung carcinoma(LLC)细胞株来源的细胞培养上清(tumor cellconditioned medium,TCCM)对粒细胞样髓源性抑制细胞(granulocytic myeloidderived suppressor cells,G-MDSC)自噬的影响;研究肿瘤微环境下的G-MDSC自噬对其自身生存与免疫抑制功能的影响;研究G-MDSC自噬对小鼠Lewis肺癌移植瘤发展的影响。方法1.G-MDSC分离及鉴定构建小鼠Lewi s肺癌移植瘤模型,磁珠分选脾脏G-MDSC,标记细胞表面Ly-6G、Ly-6C和CD11b后,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测其纯度;将分离得到的细胞涂片后进行瑞士-吉姆萨复合染液染色,观察细胞形态。2.LLC细胞株来源的TCCM的制备Lewis细胞用含有10%NBCS(newborn calf serum)的DMEM高糖培养液培养,待细胞汇合度达到90%的时候,用无血清的DMEM替换培养液,培养24h后,收集上清。3.TCCM抑制G-MDSC凋亡与上调ROS(Reactive oxygen species,ROS)用不同浓度的TCCM处理G-MDSC12h、24h,Annexin V/PI染色法,检测细胞凋亡情况,DCFDA染色后FCM检测对细胞效应分子ROS的影响。4.TCCM促进G-MDSC自噬的检测磁珠分选得到的G-MDSC在含有TCCM和氯喹(Chloroquine,CQ)的10%FBS(fatal bovine serum)RPMI 1640刺激2h、4h,收集细胞,提取总蛋白,WB(western blot)检测自噬小体形成标志物LC3Ⅱ(light chain 3Ⅱ)的水平。5.自噬抑制G-MDSC凋亡的检测磁珠分选获得G-MDSC,在含有TCCM和3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA自噬的抑制剂)RPMI 1640中培养12h、24h,收集细胞,Annexin V/PI染色,FCM检测自噬对G-MDSC生存的影响。6.自噬上调G-MDSC功能的检测将G-MDSC在含TCCM和3-MA的RPMI 1640中培养。培养12h,收集细胞,与小鼠脾脏CD4~+T细胞共培养,培养体系中加入抗CD3/CD28抗体,形成CD4~+T细胞增殖体系,通过3H-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,3H-Td R)掺入法检测CD4~+T细胞增殖情况。培养12h、24h,收集细胞,DCFDA染色后FCM检测ROS的表达;提取总蛋白检测精氨酸酶(arginase 1,ARG1)活性。7.G-MDSC自噬对小鼠Lewis肺癌移植瘤发展的影响构建小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,分别在16、23d,尾静脉注射3-MA阻断自噬的G-MDSC,观察小鼠移植瘤生长情况,FCM检测分泌IFN-γ的辅助性T细胞1型(helper T cell type 1,Th1)和细胞毒性T细胞1型(cytotoxic T lymphocytes type 1,Tc1)的比例。结果1.在体外,将不同浓度的TCCM加入到对G-MDSC培养体系中,FCM检测刺激12h、24h对细胞生存与效应分子ROS的影响。结果显示TCCM有利于G-MDSC在体外存活,存在浓度依赖效应;TCCM上调G-MDSCs的效应分子ROS的水平。2.将G-MDSC在含有TCCM和氯喹(Chloroquine,CQ)RPMI 1640中培养2h、4h,WB检测细胞中LC3Ⅱ水平。结果显示与对照组相比,TCCM处理2、4h上调了胞内LC3Ⅱ水平,表明了肿瘤微环境中,G-MDSC自噬的水平会上调(P0.01)。3.选取TCCM占培养体系体积的1/2来研究自噬对G-MDSC的影响,用3-MA抑制自噬,体外培养24h,观察抑制自噬对G-MDSC在体外存活的影响。结果显示,与1/2TCCM组相比,1/2TCCM+3-MA组活细胞比例降低,结果具有统计学差异(P0.05),表明抑制自噬,不利于G-MDSC在体外存活。4.体外检测G-MDSC对CD4~+T细胞增殖的影响,结果显示1/4TCCM+3-MA组与1/4TCCM组相比,在抑制了自噬后,G-MDSC对CD4~+T细胞增殖的抑制作用变弱,结果具有统计学差异(P0.05)。1/2TCCM+3-MA组与1/2TCCM组相比,G-MDSC抑制CD4~+T细胞增殖作用变弱,结果也具有统计学差异(P0.05)。表明抑制G-MDSC自噬后减弱了其对CD4~+T细胞增殖的抑制作用。5.体外培养12h,提取细胞总蛋白,检测ARG1活性结果显示,1/2TCCM+3-MA组与1/2TCCM组相比,在抑制了自噬后,G-MDSC细胞中ARG1活性降低,结果具有统计学差异(P0.01)。6.体外培养12、24h,细胞染色后FCM检测DCFDA平均荧光强度,以反映ROS活性。结果显示,1/2TCCM+3-MA组与1/2TCCM组相比,抑制自噬后,G-MDSC细胞中ROS活性呈下降趋势。7.造模22、24d时,1/2TCCM+3-MA处理组小鼠肿瘤体积明显小于1/2TCCM诱导的G-MDSC处理组,结果具有统计学差异(P0.05或P0.01);第25d时,1/2TCCM+3-MA处理组小鼠肿瘤重量小于1/2TCCM诱导的G-MDSC处理组,结果具有统计学差异(P0.01),并且较1/2TCCM诱导的G-MDSC组,1/2TCCM+3-MA处理组小鼠脾脏Tc1和Th1的比例均升高,Tc1升高具有统计学差异(P0.01)。这些结果表明阻断GMDSC自噬能够降低其免疫抑制功能,抗瘤免疫细胞的比例得到一定程度的恢复。结论1.TCCM在体外对G-MDSC具有促进生存、增强自噬、上调ROS的作用。2.在体外,G-MDSC自噬能够促进细胞存活并且上调其对CD4~+T细胞增殖的抑制作用,也能够上调其效应分子ROS和ARG-1。3.G-MDSC自噬有利于小鼠Lewis肺癌移植瘤的发展,这可能与G-MDSC自噬抑制Tc1和Th1细胞有关。
【关键词】：粒细胞样髓源性抑制细胞 肿瘤细胞培养上清 细胞自噬 辅助性T细胞1型 细胞毒性T细胞1型 精氨酸酶1 活性氧
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2;R730.43
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-15
• 第一章 绪论15-28
• 1.1 MDSC在肿瘤中的作用15-19
• 1.1.1 MDSC的起源和定义16-17
• 1.1.2 小鼠MDSC17-18
• 1.1.3 MDSC的免疫抑制功能18-19
• 1.2 细胞自噬19-24
• 1.2.1 概述20-22
• 1.2.2 自噬的生物学功能22-23
• 1.2.3 自噬与巨噬细胞23-24
• 1.3 研究目的、方法、实验设计及意义24-28
• 1.3.1 研究目的24
• 1.3.2 研究方法24-25
• 1.3.3 实验设计25-27
• 1.3.4 本研究的意义27-28
• 第二章 TCCM对G-MDSC生存、功能及自噬的影响28-45
• 2.1 实验仪器和材料28-33
• 2.1.1 实验仪器28
• 2.1.2 实验试剂和材料28-30
• 2.1.3 主要溶液配制30-33
• 2.1.4 实验动物33
• 2.2 实验方法33-38
• 2.2.1 构建小鼠Lewis移植瘤模型33
• 2.2.2 G-MDSC制备及纯度，形态鉴定33-35
• 2.2.3 肿瘤上清TCCM制备35
• 2.2.4 不同浓度TCCM影响G-MDSC凋亡的检测35-36
• 2.2.5 不同浓度TCCM影响G-MDSC效应分子ROS活性的检测36
• 2.2.6 Western blot检测TCCM对G-MDSC自噬的影响36-38
• 2.2.7 统计学分析38
• 2.3 实验结果38-43
• 2.3.1 免疫磁珠分选的模型小鼠脾脏G-MDSC纯度鉴定38-39
• 2.3.2 G-MDSC瑞士吉姆萨染色后镜下形态39-40
• 2.3.3 不同浓度TCCM对G-MDSC凋亡的影响40-41
• 2.3.4 不同浓度TCCM对G-MDSC ROS的影响41-42
• 2.3.5 TCCM对G-MDSC细胞内LC3蛋白含量的影响42-43
• 2.4 讨论43-45
• 第三章 自噬对G-MDSC生存及功能的影响45-55
• 3.1 实验仪器和材料45-47
• 3.1.1 实验仪器45
• 3.1.2 实验试剂和材料45-46
• 3.1.3 主要溶液配制46
• 3.1.4 实验动物46-47
• 3.2 实验方法47-50
• 3.2.1 构建小鼠Lewis肺癌移植瘤模型47
• 3.2.2 G-MDSC制备及纯度鉴定47
• 3.2.3 肿瘤上清TCCM制备47
• 3.2.4 自噬对G-MDSC凋亡影响的检测47-48
• 3.2.5 自噬对G-MDSC抑制CD4~+T细胞增殖影响的检测48-49
• 3.2.6 自噬对G-MDSC效应分子ARG-1 活性影响的检测49-50
• 3.2.7 自噬对G-MDSC效应分子ROS活性影响的检测50
• 3.2.8 统计学分析50
• 3.3 实验结果50-53
• 3.3.1 自噬抑制G-MDSC凋亡50-51
• 3.3.2 自噬增强G-MDSC对CD4~+T细胞增殖的抑制作用51-52
• 3.3.3 自噬上调G-MDSC效应分子ARG-1 活性52-53
• 3.3.4 自噬上调G-MDSC效应分子ROS活性53
• 3.4 讨论53-55
• 第四章G-MDSC自噬对小鼠LEWIS肺癌移植瘤发展的影响55-63
• 4.1 实验仪器和材料55-57
• 4.1.1 实验仪器55
• 4.1.2 实验试剂和材料55-56
• 4.1.3 主要溶液配制56
• 4.1.4 实验动物56-57
• 4.2 实验方法57-59
• 4.2.1 构建小鼠Lewis移植瘤模型57
• 4.2.2 G-MDSC体外处理57
• 4.2.3 G-MDSC自噬对小鼠肿瘤生长的影响57-58
• 4.2.4 G-MDSC自噬对小鼠脾脏中CD3~+CD8-IFN-γ+ T细胞和CD3~+CD8+IFN-γ+ T细胞比例的影响58
• 4.2.5 统计学分析58-59
• 4.3 实验结果59-62
• 4.3.1 G-MDSC自噬促进小鼠肿瘤生长59-60
• 4.3.2 G-MDSC自噬增加小鼠脾脏中CD3~+CD8-IFN-γ+T细胞和CD3~+CD8+IFN-γ+T细胞比例60-62
• 4.4 讨论62-63
• 第五章 结论、创新点及展望63-64
• 5.1 结论63
• 5.2 创新点63
• 5.3 展望63-64
• 参考文献64-70
• 致谢70-71
• 攻读硕士期间发表的文章71

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8 陈永;邹s舠

本文编号：287985