LOXL2调控IQGAP1促进肝细胞肝癌血管生成拟态形成的实验研究

发布时间：2020-11-09 12:24

　　 研究目的:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升,现已成为世界范围内第三大最常见的癌症死亡原因。肿瘤血管生成是肿瘤生长、侵袭、转移的重要步骤,因此抗血管治疗已成为当前防治研究的热点。血管生成拟态(Vasculogenic mimicry,VM)是一种不同于内皮依赖性血管的特殊的肿瘤血液供应模式,其存在与肿瘤的不良预后相关,但其发生的机制尚不明确。本研究采用免疫组化方法检测了赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)、含有IQ模体的Ras GTP酶活化蛋白1(IQGAP1)、VM在201例HCC组织中的表达情况,分别分析LOXL2、IQGAP1与VM及临床资料的关系,并探讨LOXL2与IQGAP1的相关性。通过细胞转染、免疫印迹等细胞实验研究LOXL2、IQGAP1对HCC细胞迁移、侵袭、增殖及形成VM能力的影响,研究其促进HCC发生发展的机制,从而为HCC的靶向治疗提供新的分子靶点。研究方法:1.本研究收集了经手术切除的肝细胞肝癌组织标本201例,以上标本均来自天津医科大学肿瘤医院、天津医科大学总医院,所取标本均经病理医师确诊。采用免疫组化和CD31/PAS双染,检测LOXL2、IQGAP1的表达水平和VM的存在情况。分别分析LOXL2、IQGAP1的表达与HCC临床病理因素、VM及其与患者生存预后的关系,并分析LOXL2与IQGAP1之间的相关性。2.应用Western blot检测LOXL2在肝癌细胞系中的本底表达,筛选出本底低表达和高表达的细胞系。采用质粒转染的方法调节LOXL2的表达,构建并筛选出相应的稳定转染细胞系。运用划痕、迁移、侵袭、三维培养实验检测LOXL2对肝癌细胞迁移、侵袭和VM形成能力的影响。Western blot鉴定转染效率并检测VM相关分子VE-vadherin、MMP2、MMP9的表达变化,并采用免疫荧光法验证。3.采用质粒转染的方法,将IQGAP1下调质粒转入上述LOXL2上调稳转细胞系中;将IQGAP1上调质粒转入上述LOXL2下调稳转细胞系中。划痕、迁移、侵袭、三维培养、免疫印迹实验检测IQGAP1对于LOXL2功能恢复的影响。免疫共沉淀实验检测LOXL2与IQGAP1的关系。4.应用Western blot检测IQGAP1在肝癌细胞系中的表达情况,筛选出本底低表达和高表达IQGAP1的细胞系。采用质粒转染的方法调节IQGAP1的表达,构建转染细胞系。运用划痕、迁移、侵袭、三维培养、平板克隆、软琼脂克隆和MTT增殖实验检测IQGAP1对肝癌细胞迁移、侵袭、VM形成以及增殖能力的影响。采用Western blot法鉴定转染效率并检测VM相关分子VE-vadherin、MMP2、MMP9的表达变化。研究结果:1.201例HCC组织免疫组化结果显示:LOXL2在肝癌细胞的胞质和胞核中表达,IQGAP1在肝癌细胞的胞质和胞膜中表达。LOXL2和IQGAP1在HCC组织中高表达,与肿瘤分级、转移、VM相关,且LOXL2与IQGAP1的表达呈正相关。生存分析显示LOXL2、IQGAP1阳性患者的预后均较差。2.在肝癌细胞系中,筛选出LOXL2高表达细胞系Bel7402和低表达细胞系Hep G2。在Bel7402中转染LOXL2下调质粒,出现了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达降低,迁移、侵袭、管道形成能力均减弱。在Hep G2中转染LOXL2上调质粒,出现了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达升高,迁移、侵袭、管道形成能力均增强。3.在Bel7402下调LOXL2细胞系中,转染IQGAP1上调质粒,出现了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达升高,迁移、侵袭、管道形成能力均增强。在Hep G2上调LOXL2细胞系中,转染IQGAP1下调质粒,出现了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达降低,迁移、侵袭、管道形成能力均减弱。Co-IP结果显示LOXL2可以与IQGAP1相结合。LOXL2可能是通过调控IQGAP1的表达来影响肝癌细胞侵袭、迁移及VM形成的能力。4.在肝癌细胞系中,筛选出IQGAP1高表达细胞系SMMC7721和低表达细胞系Hep G2。在SMMC7721中转染IQGAP1下调质粒,出现了VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达降低,迁移、侵袭、管道形成能力均减弱。平板克隆、软琼脂克隆、MTT增殖实验显示,IQGAP1的下调抑制了SMMC7721细胞的增殖能力。在Hep G2中转染IQGAP1上调质粒,出现了VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达升高,迁移、侵袭、管道形成能力均增强。平板克隆、软琼脂克隆、MTT增殖实验显示,IQGAP1的上调增强了Hep G2细胞的增殖能力。以上结果显示:IQGAP1在肝癌发生发展过程中扮演了重要的角色,IQGAP1的上调可以明显促进肝癌细胞的恶性生物学行为。5.LOXL2通过调控IQGAP1的表达来促进肝细胞肝癌血管生成拟态的形成。当LOXL2上调时出现了IQGAP1的高表达,LOXL2可以与更多的IQGAP1相结合,从而促进肝癌细胞的迁移侵袭能力,进而促进肝癌VM的形成。在LOXL2表达水平低的细胞系中上调IQGAP1的表达,上调的IQGAP1可以弥补LOXL2下调所引起的对迁移、侵袭、VM的抑制能力。这表明LOXL2是通过调控IQGAP1来促进肝癌细胞的恶性生物学行为,IQGAP1在肝细胞肝癌血管生成拟态的形成中起重要作用。研究结论:1.LOXL2和IQGAP1在肝癌组织中高表达,与肿瘤分级、转移、VM形成相关,且影响患者预后。LOXL2与IQGAP1存在相关关系。2.LOXL2可以通过IQGAP1促进肝癌细胞的迁移、侵袭、管道形成能力。3.IQGAP1能增强肝癌细胞的迁移、侵袭、增殖、管道形成能力,促进其恶性生物学行为的进展。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

天津医科大学硕士学位论文 一、LOXL2、IQGAP1 在 HCC 组织中的表达及其与 VM 的关系CD31/PAS 染色后内皮依赖性血管显示 CD31,PAS 双阳性；VM 显示 CD31 阴性，PAS 阳性。图 1.1 中红色剪头所指的为 VM，由肿瘤细胞围成的管道，基底膜在周围包围，管腔内有红细胞衬覆。

男 39 130女 9 23）<5 3 78≥ 5 45 75I/II 8 88III/IV 40 65无 10 110有 38 43生存分析法分析 VM 对生存的影响，我们得出M 的患者生存期更短。如图 1.2 所示：在 201 例者的预后比无 VM 组的预后差。无 VM月，VM 组的平均生存时间 25.415±3.316 月，p<0.01）。

51.74%），97 例 LOXL2 阴性（97/201,48.26%）。根据 LOXL2 染色结果，将 201 例肝癌组织标本分为 2 组，LOXL2 阳性组和 LOXL2 阴性组。图1.3 免疫组化显示LOXL2在HCC中的表达情况。图a显示LOXL2阳性表达定位于细胞核和细胞浆，图b为LOXL2阴性表达。为了解 LOXL2 在肝癌组织中发挥的作用，我们分析了 LOXL2 与临床病历资料之间的关系。结果表明肝癌组织中 LOXL2 的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小均无关，而与肿瘤分级、转移、VM 均相关（p<0.05）（表 1.3）。在 104例 LOXL2 阳性患者中，存在 VM 患者 32 例（32/104,30.77%）；在 97 例 LOXL2阴性患者中，存在 VM 患者 16 例（16/97,16.5%）。同时，根据 KM 生存分析法，我们分析了 LOXL2 对 201 例肝癌患者生存预后情况的影响
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本文编号：2876426