结直肠癌是最常见的人类恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。随着手术、化疗及靶向药物联合治疗的综合应用,结直肠癌的生存率得到了一定程度的提高,但部分患者治疗效果仍然不尽人意。因此,寻找结直肠癌治疗特异性和灵敏性的靶点,提高结直肠癌的治疗效果是目前所面临的难题。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族是一组跨膜糖蛋白,它具有酪氨酸激酶的活性,包括HER1(ERBB1/EGFR)、HER2(ERBB2)、HER3(ERBB3)、HER4(ERBB4)四个家族成员。HER4作为表皮生长因子受体家族的第4号成员,具有EGFR家族成员共同的结构特征。有研究提示,HER4与多种恶性肿瘤的发生发展及不良的预后密切相关。?目前关于HER4在结直肠癌中表达的意义及HER4的预测价值方面的研究十分有限,而且存在争议。因此需要更多的研究来明确HER4蛋白在结直肠癌中的表达情况及其与预后的关系。本研究通过应用免疫组化检测结直肠癌组织中HER4表达情况及其临床意义,构建能够靶向抑制HER4基因的慢病毒shRNA载体,并观察其基因沉默的效果,建立沉默HER4基因的结肠癌细胞株。观察HER4对结肠腺癌细胞增殖、凋亡、黏附及上皮间质转化的影响。第一部分HER4在结直肠癌中表达的临床意义目的:检测结直肠癌组织中HER4蛋白的表达情况,探讨HER4蛋白在结直肠癌中的临床意义。方法:1采用免疫组化的方法检测90例结直肠癌组织标本中HER4蛋白的表达情况。2评价HER4蛋白的表达情况与临床病理特征之间的关系;采用统计方法分析HER4蛋白与结直肠癌患者生存期之间的关系。结果:1.临床病理特征经过电话回访了解90例结直肠癌患者的生存情况,其中73例患者成功得到生存资料,随访率为81.1%。73例随访成功的患者包括结肠癌28例,直肠癌45例;男性36例,女性37例;≤60岁38例,60岁35例;Ⅰ期+Ⅱ期41例,Ⅲ期32例;T_1期2例,T_2期14例,T_3期22例,T_4期35例;淋巴结转移阴性41例,淋巴结转移阳性32例。随访过程有19人死亡,死亡原因均为术后肿瘤的远处转移,其中肺转移11例,骨转移4例,多发转移5例,总生存率为73.97%。2.HER4在正常结直肠组织及癌组织中的表达情况HER4在正常结直肠组织中均为阴性表达,在结直肠癌组织中阳性表达的为25例,阳性表达率34.2%,阳性表达主要定位在细胞质和细胞膜中,表现为浅黄、棕黄及棕褐色不同强度的染色。HER4阴性表达的为48例,阴性表达率为65.8%。3.HER4与结直肠癌各临床病理参数之间的关系HER4的表达水平与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位和分期均无显著相关性(P0.05),与淋巴结转移有显著相关性(P0.05)。淋巴结阳性的患者阳性率高于淋巴结阴性的患者(60.0%VS 40.0%,P=0.039)。4.HER4与结直肠癌患者5年生存率的关系HER4阳性的患者5年生存率为64.3%,HER4阴性的患者5年生存率为85.5%,两者比较有显著差异,HER4阳性患者的预后劣于HER4阴性的患者(P=0.020)。小结:结直肠癌组织中的HER4阳性表达与肿瘤的淋巴结转移相关,HER4阳性患者的预后劣于HER4阴性的患者。第二部分HER4基因沉默结肠癌细胞株的建立目的:构建针对人HER4基因的短发夹结构RNA(shRNA)及其表达载体,转染人结肠癌细胞,建立HER4基因沉默的结肠癌细胞株。方法:1通过基因查序获得4条HER4基因的靶序列,连接到LV3慢病毒载体上,成功构建携带HER4基因的慢病毒sh RNA载体。2包装慢病毒,转染293T细胞,获得高滴度的慢病毒浓缩液,对慢病毒浓缩液进行病毒滴度的测定。3通过RT-PCR及Western Blot验证干扰效果,建立HER4基因沉默的结肠癌细胞株。结果:1.慢病毒载体的构建HER4-shRNA1-4干扰载体经测序,结果与HER4-shRNA1-4寡居单链正链序列完全一致,证明4条HER4基因干扰载体构建成功。2.慢病毒滴度测定通过荧光显微镜结合稀释倍数计算病毒滴度,测得4组慢病毒滴度分别为:HER4-shRNA1的感染滴度约为3×10~8TU/mLHER4-shRNA2的感染滴度约为1×10~8TU/mLHER4-shRNA3的感染滴度约为1×10~8TU/mLHER4-shRNA4的感染滴度约为2×10~8TU/mL3.慢病毒感染细胞情况当慢病毒的感染滴度达到1×10~8TU/mL时,按照1:5稀释进行感染,shHER4-1、shHER4-2、shHER4-3和shHER4-4四组病毒感染效率基本可达70%以上。4.ShRNA慢病毒对HCT116细胞HER4 mRNA表达的影响shHER4-1、shHER4-2、shHER4-3和shHER4-4组HER4 mRNA相对于H-ACTB的表达水平分别为1.18±0.22、3.77±0.55、1.17±0.15、0.54±0.01,与阴性对照组(1.13±0.13)及空白对照组(1.0±0.13)相比shHER4-4的mRNA表达水平明显降低(P0.05)。5.ShRNA慢病毒对HCT116细胞HER4蛋白表达影响HCT116细胞、阴性对照细胞和shHER4-4组HER4蛋白表达水平灰度值分别为2070±50、1446±48、769±37,shHER4-4组HER4蛋白表达水平灰度值有明显减弱(P0.05)。小结:利用RNA干扰技术成功地建立了HER4基因沉默的结肠癌细胞株,为下一步实验提供了实验材料。第三部分HER4对结肠癌细胞增殖、凋亡、黏附及上皮间质转化的影响目的:研究HER4对结肠癌细胞增殖、凋亡及及黏附的影响,探讨HER4在结肠癌细胞上皮间质转化中的作用,为临床通过调节结直肠癌HER4蛋白水平抑制肿瘤的侵袭转移提供理论基础。方法:1应用MTT、流式细胞检测法和细胞基质黏附实验分别检测三组细胞的增殖、凋亡和黏附的情况。2应用Western blot检测三组细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达。3应用免疫荧光双染法检测三组细胞E-cadherin和Vimentin的表达。结果:1.沉默HER4基因对细胞增殖的影响shRNA-HER4与空白对照及阴性对照组在24h、48h、72h相比较,OD值均明显减小,差异有统计学意义(shRNA-HER4组VS空白对照组:P0.05;shRNA-HER4组VS阴性对照组:P0.05)。2.沉默HER4基因对细胞凋亡的影响shRNA-HER4、空白对照及阴性对照组细胞凋亡率分别为(3.43±0.67)%、(0.76±0.33)%、(0.9±0.35)%。shRNA-HER4组与空白对照及阴性对照组相比较凋亡率差异有统计学意义(shRNA-HER4组VS空白对照组:P0.05;shRNA-HER4组VS阴性对照组:P0.05)。3.沉默HER4基因对细胞基质黏附的影响。shRNA-HER4组细胞黏附的数量较空白对照和阴性对照组显著增加(P0.05)。shRNA-HER4组OD值在1h和2h较空白对照和阴性对照组显著增加,差异有统计学意义(shRNA-HER4组VS空白对照组:P0.05;shRNA-HER4组VS阴性对照组:P0.05)。4.Western blot检测沉默HER4基因对细胞上皮间质转化的影响。shRNA-HER4组细胞中上皮标志物E-cadherin的表达较空白对照和阴性对照组显著上调(P0.05),而间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达水平较空白对照和阴性对照组显著下调(P0.05)5.免疫荧光双染法检测E-cadherin和Vimentin的表达shRNA-HER4、空白对照和阴性对照组三组细胞比较shRNA-HER4组细胞中上皮标志物E-cadherin较空白对照和阴性对照组显著增多(P0.05),而间质标志物Vimentin较空白对照和阴性对照组显著较少(P0.05)。小结:HER4不仅促进细胞增殖抑制凋亡,还可以促进细胞发生上皮间质转化,进而减少结直肠肿瘤细胞黏附性促进肿瘤转移。结论:1.结直肠癌组织中的HER4阳性表达与肿瘤的淋巴结转移相关,HER4阳性患者的预后劣于HER4阴性的患者。2.利用RNA干扰技术成功地建立了HER4基因沉默的结肠癌细胞株,为下一步实验提供了实验材料。3.HER4不仅促进细胞增殖抑制凋亡,还可以促进细胞发生上皮间质转化,进而减少结直肠肿瘤细胞黏附性促进肿瘤转移。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.34
【部分图文】：
图 1 HER4 在正常结直肠组织中阴性表达(SP 法)Fig.1 HER4 negative expression in colorectal tissuesbar=20μm(×200).
图 1 HER4 在正常结直肠组织中阴性表达(SP 法)Fig.1 HER4 negative expression in colorectal tissuesbar=20μm(×200).
21图 4 HER4 阳性表达和阴性表达组的生存曲线的比较Fig.4 The association of 5-year survival with HER4.The prognosis of HER4 positive patients was inferior to that of HER4negative (P =0.020).
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 连戴政;刘雅洁;;粪便miRNA标志物在结直肠癌筛选和诊断中的应用研究进展[J];肿瘤学杂志;年期
2 张慧敏;包含;付蓉;刘丹;刘美娜;;医院结直肠癌治疗质量评价指标体系的建立[J];中国医院统计;2015年01期
3 顾磊;;年轻结直肠癌的临床病理特征分析[J];实用癌症杂志;2018年11期
4 陶杰夫;;“吃货”需注意的癌症——结直肠癌[J];消费者报道;2015年05期
5 许晶;牛昱欣;王贵来;魏鑫;刘红箭;;结直肠癌患者临床资料的对比分析[J];中国现代医学杂志;2017年28期
6 李娟;杨柱;唐东昕;龙奉玺;罗莉;王镜辉;郭斌;陈杰;王倩;;中医药防治结直肠癌研究进展[J];湖南中医杂志;2017年12期
7 陈岩松;陈燕;陈娜娟;;结直肠癌患者血清白细胞介素6水平及与肿瘤疗效关系[J];标记免疫分析与临床;2017年11期
8 伍世钢;罗枫;李进邦;刘坤平;;结直肠癌1085例临床病理特征及预后分析[J];广东医学;2017年23期
9 陈劲松;;重视间期结直肠癌的预防[J];中华普通外科学文献(电子版);2017年06期
10 王福奇;周全博;孙振强;刘金波;杨帅玺;连玉贵;孙献涛;宋军民;袁维堂;;河南地区结直肠癌发病特征分析[J];中国全科医学;2018年03期
相关博士学位论文 前10条
1 龚磊;miR-92b-3p通过靶向FBXW7促进结直肠癌恶性行为的机制研究[D];重庆医科大学;2018年
2 吕真冰;c-Myc/miR-200b-3p/PRDX2反馈环调控结直肠癌转移的研究[D];重庆医科大学;2018年
3 李亚伦;Loc554202通过miR-31调控ABCB9表达水平影响结直肠癌对奥沙利铂的耐药性[D];中国医科大学;2018年
4 于一凡;COL1A2对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制研究[D];中国医科大学;2018年
5 吕赤;B细胞转位基因3（BTG3）在结直肠癌发生发展中的作用及机制研究[D];中国医科大学;2018年
6 李月;长链非编码RNA XLOC_010588和NAV2-AS5调节结直肠癌侵袭迁移作用的研究[D];中国医科大学;2018年
7 杨娟丽;Caveolin-1调控表皮生长因子受体活化对结直肠癌细胞增殖和转移的影响[D];河北医科大学;2018年
8 刘亚彬;SM22α在结直肠癌中的表达及作用[D];河北医科大学;2018年
9 牛巍巍;TL1A在炎症相关结直肠癌中的作用及机制研究[D];河北医科大学;2018年
10 郭燕;HER4在结直肠癌中表达的意义及其对细胞增殖、凋亡、黏附及上皮间质转化的影响[D];河北医科大学;2018年
相关硕士学位论文 前10条
1 刘文文;老年综合评估在结直肠癌患者围手术期的应用及效果评价[D];重庆医科大学;2018年
2 吴海霞;FOXG1在结直肠癌侵袭与转移的作用机制研究[D];重庆医科大学;2018年
3 刘浩;ETV4基因在人结直肠癌中的功能研究以及临床意义[D];重庆医科大学;2018年
4 陈伊;结直肠癌患者肝转移相关miRNA的表达及其临床意义的研究[D];广西医科大学;2017年
5 阳祖庆;MiR-630在结直肠癌中的表达及作用研究[D];广西医科大学;2017年
6 黄文英;手穴按摩疗法促进结直肠癌术后胃肠功能恢复的随机对照研究[D];成都中医药大学;2017年
7 闫丽红;分别下调MRPL35、RasGRF2对大肠癌裸鼠移植瘤模型肿瘤生长和转移的影响[D];山西医科大学;2018年
8 陈美旭;帕罗西汀联合氟尿嘧啶对结直肠癌伴抑郁小鼠药物干预的研究[D];中国医科大学;2018年
9 孙亚超;加速康复外科在结直肠癌患者围术期的应用研究[D];新疆医科大学;2018年
10 王治博;术前血浆Fg和D-D水平与结直肠癌预后关系的研究[D];中国医科大学;2018年
本文编号：
2882663
