STAT3及其靶基因对非小细胞肺癌生物学行为调控机制的初步实验研究

发布时间：2020-11-15 11:02

　　 研究背景肺癌占我国恶性肿瘤发病率及死亡率的首位,非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的80%,在现有卫生技术条件下,约75%的患者就诊时就已属中晚期,总体5年生存率不足15%,肺癌严重威胁着人类的生命健康。到目前为止,肺癌的发病机制仍未从根本上阐明。探讨肺癌的发生与演变机制,对于降低肺癌的发病率及寻找新的防治途径十分重要。近年来研究发现,信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)具有强烈的抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生与发展。STAT3是信号转导和转录激活因子家族(STAT)的重要成员,表现尤为活跃。STAT3信号通路与细胞的生长、增殖及凋亡的关系十分密切,该通路的持续激活可以导致细胞异常增殖与恶性转化,与肿瘤的发生、发展密切相关,目前已将STAT3定义为癌基因。STAT3在接受非受体酪氨酸激酶、细胞因子以及生长因子等细胞外信号刺激后被磷酸化激活,形成磷酸化的STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3),p-STAT3会迅速移至细胞核内,与靶基因的启动子相结合,激活靶基因的转录,进而影响细胞的生长、增殖与凋亡。在正常生理情况下,STAT3的激活只是暂时的,在STAT3完成特定的信号传递后,会被去磷酸化,并重新回到细胞质中。而在各种致癌信号的刺激下,STAT3将会被持续激活,以活化的状态恒定地存于细胞核中,激活并调控诸女VEGF、VEGF-C及MUC1等靶基因的转录,促进肿瘤细胞的增殖与浸润转移,与肿瘤的发生、发展密切相关。已有较多文献报道STAT3信号在多种恶性肿瘤中存在异常表达,阻断STAT3信号可以诱导肿瘤细胞凋亡,使肿瘤的生长受抑。随着对STAT3信号通路的深入研究,STAT3在肿瘤发生发展过程中所起的作用越来越受到重视,以STAT3为靶点的治疗方法有望为某些恶性肿瘤的治疗开辟新的途径。NSCLC中是否存在STAT3信号转导通路,激活状态的STAT3是否参与了NSCLC的发生与发展,至今在国内外的文献报道较少。本课题通过应用Western免疫印迹及免疫组织化学等技术探讨了STAT3信号与NSCLC临床病理特征之间的关系；探讨了NSCLC组织中STAT3与靶基因VEGF、VEGF-C及MUC1之间的相关性；并结合NSCLC患者的随访资料,探讨了STAT3及其靶基因与NSCLC的预后关系,利用RNA干扰技术阻断人肺腺癌A549细胞中活化的STAT3信号通路,探讨阻断STAT3信号通路的活性对肺癌细胞增殖、凋亡的影响等,以求从体内、到体外,从分子到蛋白水平多角度探讨STAT3信号通路在NSCLC发生与发展的作用机制,为NSCLC的基因治疗筛选理想的靶标提供理论基础。第一部分STAT3、p-STAT3在非小细胞肺癌组织中的表达及其与临床病理特征之间的相关性目的：探讨STAT3、p-STAT3在NSCLC组织中的表达情况及其与临床特征之间的相关性。方法：本实验收集了2011年9月至2011年12月在山东省立医院胸外科施行肺癌手术的72例NSCLC患者的标本,包括72例NSCLC组织及随机选取的20例癌旁正常肺组织。应用Western blot与免疫组化方法检测NSCLC组织和癌旁正常肺组织中STAT3蛋白及p-STAT3蛋白的表达情况。应用SPSS13.0统计分析软件,将患者的临床资料、病理学特征以及实验结果共同建立数据库。计数资料采用χ2检验或Fisher's精确概率检验法；计量资料应用均数±标准差(x±s)表示,两组均数比较时采用独立样本t检验(方差齐时)或t'检验(方差不齐时),多组计量资料样本比较应用方差分析(F检验),若差别有统计学意义,则行SNK检验(q检验)进行两两比较,P0.05为具有统计学意义。结果：Western blot显示NSCLC组织中STAT3及p-STAT3的表达量均显著高于癌旁正常肺组织(P0.01,P0.01)。STAT3的表达量随pTNM分期的加重显著增高(P0.05)。p-STAT3的表达量与患者肿瘤的病理分型、淋巴结转移显著相关,腺癌患者p-STAT3表达量显著高于鳞癌患者(P0.05)；淋巴结转移组p-STAT3表达量显著高于无淋巴结转移组(P0.01)。p-STAT3表达量随pTNM分期的加重显著增高(P0.01)。免疫组化法检测STAT3的阳性表现为细胞浆和/或细胞核内出现棕黄色颗粒。p-STAT3的阳性表现为细胞核内出现棕黄色颗粒。NSGLC组织中STAT3、 p-STAT3的表达均显著高于癌旁正常肺组织(P0.01,P0.05)。STAT3的表达随pTNM分期的加重均显著增高(P0.01)。p-STAT3的表达与患者肿瘤的病理分型、淋巴结转移显著相关,腺癌患者p-STAT3的表达显著高于鳞癌患者(P0.05)；有淋巴结转移的组p-STAT3的表达显著高于无淋巴结转移组(P0.01)。结论：NSCLC中存在高表达的STAT3及p-STAT3。NSCL C组织中STAT3的表达与pTNM分期显著相关,p-STAT3的表达与病理类型、淋巴结转移及pTNM分期显著相关,STAT3信号参与了NSCLC的发生发展,激活的STAT3在NSCLC的浸润转移中起着一定的作用。较应用方差分析(F检验),若差别有统计学意义,则行SNK检验(q检验)进行两两比较,P0.05为具有统计学意义。结果：Western blot显示NSCLC组织中STAT3及p-STAT3的表达量均显著高于癌旁正常肺组织(P0.01,P0.01)。STAT3的表达量随pTNM分期的加重显著增高(P0.05)。p-STAT3的表达量与患者肿瘤的病理分型、淋巴结转移显著相关,腺癌患者p-STAT3表达量显著高于鳞癌患者(P0.05)；淋巴结转移组p-STAT3表达量显著高于无淋巴结转移组(P0.01)。p-STAT3表达量随pTNM分期的加重显著增高(P0.01)。免疫组化法检测STAT3的阳性表现为细胞浆和/或细胞核内出现棕黄色颗粒。p-STAT3的阳性表现为细胞核内出现棕黄色颗粒。NSGLC组织中STAT3、 p-STAT3的表达均显著高于癌旁正常肺组织(P0.01,P0.05)。STAT3的表达随pTNM分期的加重均显著增高(P0.01)。p-STAT3的表达与患者肿瘤的病理分型、淋巴结转移显著相关,腺癌患者p-STAT3的表达显著高于鳞癌患者(P0.05)；有淋巴结转移的组p-STAT3的表达显著高于无淋巴结转移组(P0.01)。结论：NSCLC中存在高表达的STAT3及p-STAT3。NSCL C组织中STAT3的表达与pTNM分期显著相关,p-STAT3的表达与病理类型、淋巴结转移及pTNM分期显著相关,STAT3信号参与了NSCLC的发生发展,激活的STAT3在NSCLC的浸润转移中起着一定的作用。第二部分非小细胞肺癌组织中STAT3信号与靶基因VEGF、VEGF-C、及MUC1关系的研究目的：探讨NSCLC组织中STAT3、p-STAT3与靶基因VEGF、VEGF-C、及MUC1的关系。方法：本研究选取2011年9月至2011年12月在山东省立医院胸外科施行肺癌手术的72例NSCLC患者的标本,包括72例NSCLC组织及随机选取的20例癌旁正常肺组织。应用免疫组化技术检测NSCLC组织及癌旁正常肺组织STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGF-C、及MUC1的表达情况。应用SPSS13.0统计分析软件,将患者的临床资料、病理学特征以及实验结果共同建立数据库。应用χ2检验或Fisher's精确概率检验法比较STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGF-C、及MUC1在各组标本中表达的差异情况,各因子之间相关性分析采用Spearman等级法,P0.05为具有统计学意义。结果：VEGF日性表达为细胞浆出现棕黄色颗粒,VEGF-C阳性表达为细胞浆出现棕黄色颗粒,MUC1日性表达为细胞浆出现棕黄色颗粒。VEGF、VEGF-C、及MUC1蛋白的表达均显著高于癌旁正常肺组织(P0.05,P0.05, P0.05)。VEGF的表达与患者肿瘤大小(pT)、淋巴结转移及pTNM分期显著相关(P0.05,P0.01,P0.05)。VEGF阳性表达率随肿瘤的增大、随pTNM分期的加重显著增高。在52例有淋巴结转移的肺癌组织中,有37例(71.6%)存在VEGF表达阳性；在20例没有淋巴结转移的肺癌组织中,有8例(40.0%)存在VEGF表达阳性,二者相比,差异显著(P0.05)。在52例有淋巴结转移的肺癌组织中,有36例(69.2%)存在VEGF-C表达阳性；在20例没有淋巴结转移的肺癌组织中,有6例(30.0%)存在VEGF-C表达阳性,二者相比,差异显著(P0.01)。MUC1阳性表达率随肿瘤的增大(pT)显著增高(P0.01),MUC1在有淋巴结转移的肺癌组中的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(71.6%:30.0%, P0.01)。Spearman等级相关分析表明,在NSCLC组织中STAT3表达与p-STAT3表达呈显著正相关(r=0.307,P0.01),与VEGF表达呈显著正相关(r=0.309,P0.01); p-STAT3表达与VEGF表达呈显著正相关(r=0.381,P0.01),与MUC1表达呈显著正相关(r=0.495,P0.01)；结论：VEGF在NSCLC组织中呈高表达,与肿瘤大小、淋巴结转移及pTNM分期显著相关。VEGF-C在NSCLC组织中呈高表达,与淋巴结转移显著相关。MUC1在NSCLC组织中呈高表达,与肿瘤大小、淋巴结转移显著相关。NSCLC组织中STAT3、p-STAT3及VEGF三者的表达呈显著正相关,p-STAT3与MUC1的表达呈显著正相关。STAT信号通路可能通过调控VEGF、MUC1的表达促进NSCLC的发生发展、浸润转移。第三部分STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGF-C、及MUC1与非小细胞肺癌预后的关系目的：探讨STAT3、p-STAT3及其靶基因VEGF、VEGF-C、及MUC1与NSCLC预后的关系。方法：本研究选取2011年9月至2011年12月在山东省立医院胸外科施行肺癌手术的72例NSCLC患者的标本,包括72例NSCLC组织及随机选取的20例癌旁正常肺组织。应用免疫组化技术检测NSCL C组织及STAT3、p-STAT3、VEGF、 VEGF-C.及MUC1的表达情况。并对患者出院后进行跟踪随访,应用SPSS13.0软件进行统计分析,Kaplan-Meier法计算生存率,Log-rank检验比较生存率差别,Cox回归分析判定手术后生存率的预后因素。P0.05表示有统计学意义。结果：应用Kaplan-Meie r生存曲线分析显示本组NSCLC患者3年生存率是54.2%,肿瘤大小(pT)、淋巴结转移、pTNM分期、STAT3、p-STAT3、VEGF、MUC1是影响NSCLC患者3年生存率的相关因素。肿瘤大小(pT)不同组别3年生存率分别为：pTl组100%,pT2组52.8%,pT3组27.3%;经Log-Rank检验总体间差别具有统计学意义(P0.01)。淋巴结转移阳性组患者的3年生存率显著低于淋巴结转移阴性组患者的3年生存率(38.5%：95.0%,P0.01)。而pTNM分期不同组别3年生存率分别为：pⅠ组94.1%,pⅡ组51.4%,pⅢ组22.2%。经Log-Rank检验总体间差别具有统计学意义(P0.01)。STAT3表达阳性组患者的3年生存率同样显著低于STAT3表达阴性组患者的3年生存率(45.9%：100%,P0.01)(图8)。p-STAT3表达阳性组患者的3年生存率显著低于p-STAT3表达阴性组患者的3年生存率(43.6%：66.7%,P0.05)。VEGF表达阳性组患者的3年生存率显著低于VEGF表达阴性组患者的3年生存率(44.4%：70.4%,P0.05)。MUC1蛋白表达阳性组患者的3年生存率显著低于MUC1表达阴性组患者的3年生存率(44.2:69.0%,P0.05)。VEGF-C阳性组患者3年生存率分别为46.5%,虽然低于VEGF-C阴性组患者3年生存率的65.5%,经Log-Rank检验分析,总体间差别无统计学意义(P0.05)。Cox多因素回归分析结果显示,淋巴结转移是NSCLC患者手术后3年生存率的独立危险因素。第三部分STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGF-C、及MUC1与非小细胞肺癌预后的关系目的：探讨STAT3、p-STAT3及其靶基因VEGF、VEGF-C、及MUC1与NSCLC预后的关系。方法：本研究选取2011年9月至2011年12月在山东省立医院胸外科施行肺癌手术的72例NSCLC患者的标本,包括72例NSCLC组织及随机选取的20例癌旁正常肺组织。应用免疫组化技术检测NSCL C组织及STAT3、p-STAT3、VEGF、 VEGF-C.及MUC1的表达情况。并对患者出院后进行跟踪随访,应用SPSS13.0软件进行统计分析,Kaplan-Meier法计算生存率,Log-rank检验比较生存率差别,Cox回归分析判定手术后生存率的预后因素。P0.05表示有统计学意义。结果：应用Kaplan-Meie r生存曲线分析显示本组NSCLC患者3年生存率是54.2%,肿瘤大小(pT)、淋巴结转移、pTNM分期、STAT3、p-STAT3、VEGF、MUC1是影响NSCLC患者3年生存率的相关因素。肿瘤大小(pT)不同组别3年生存率分别为：pTl组100%,pT2组52.8%,pT3组27.3%;经Log-Rank检验总体间差别具有统计学意义(P0.01)。淋巴结转移阳性组患者的3年生存率显著低于淋巴结转移阴性组患者的3年生存率(38.5%：95.0%,P0.01)。而pTNM分期不同组别3年生存率分别为：pⅠ组94.1%,pⅡ组51.4%,pⅢ组22.2%。经Log-Rank检验总体间差别具有统计学意义(P0.01)。STAT3表达阳性组患者的3年生存率同样显著低于STAT3表达阴性组患者的3年生存率(45.9%：100%,P0.01)(图8)。p-STAT3表达阳性组患者的3年生存率显著低于p-STAT3表达阴性组患者的3年生存率(43.6%：66.7%,P0.05)。VEGF表达阳性组患者的3年生存率显著低于VEGF表达阴性组患者的3年生存率(44.4%：70.4%,P0.05)。MUC1蛋白表达阳性组患者的3年生存率显著低于MUC1表达阴性组患者的3年生存率(44.2:69.0%,P0.05)。VEGF-C阳性组患者3年生存率分别为46.5%,虽然低于VEGF-C阴性组患者3年生存率的65.5%,经Log-Rank检验分析,总体间差别无统计学意义(P0.05)。Cox多因素回归分析结果显示,淋巴结转移是NSCLC患者手术后3年生存率的独立危险因素。结论：肿瘤大小(pT)、淋巴结转移、pTNM分期、STAT3、p-STAT3、VEGF、MUC1与NSCLC患者的3年生存率显著相关。淋巴结转移是NSCLC患者手术后3年生存率的独立危险因素。第四部分STAT3 siRNA体外阻断人肺腺癌A549细胞系中STAT3信号通路活性的研究目的：探讨STAT3siRNA阻断STAT3信号后肺腺癌A549细胞生长、凋亡的变化情况。方法：将STAT3siRNA转染入肺腺癌A549细胞,作转染组。将未用STAT3siRNA、仅用转染试剂模拟转染过程的细胞作为未转染组(对照组)细胞。Western Blotting法检测转染STAT3siRNA后0,24,48及72h STAT3、p-STAT3蛋白表达水平。Real-timePCR法检测转染STAT3siRNA后0,24,48及72hSTAT3mRNA表达水平。MTT法检测转染组及未转染组肺腺癌A549细胞24、48h及72h后细胞的增殖情况。转染组及未转染组肺腺癌A549细胞细胞用Annexin V-FITC和PⅠ将细胞合染,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况和细胞周期的变化情况。通过SPSS13.0统计分析软件,计量资料应用均数±标准差(x±s)表示,两组均数比较时采用独立样本t检验,多组计量资料样本比较应用方差分析,P0.05为具有统计学意义。结果：显微镜下观察,STAT3siRNA转染肺癌细胞系A549细胞后,细胞开始增殖减慢,48小时后形态出现明显变化细胞皱缩变小,出现较多的悬浮细胞。对照组的细胞轮廓清楚,细胞排列紧密,生长旺盛。A549细胞转染STAT3siRNA后0、24、48、72小时,STAT3mRNA和STAT3蛋白的表达水平在转染STAT3siRNA后随时间呈下降趋势,在转染后48小时呈显著下降,在转染后72小时仅能检测到很极少量的STAT3蛋白；p-STAT3蛋白的表达量与STAT3蛋白有相同的趋势,随转染的时间呈下降趋势,尤其在转然后的48小时呈显著下降；p-actin为STAT3siRNA的非靶向蛋白,在转染后的各时间段均未见明显变化。MTT法检测转染后24、48和72小时后细胞的增殖能力,结果显示A549细胞转染STAT3siRNA48小时、72小时A值与对照组A值相比,具有明显差异。A549细胞转染STAT3siRNA24小时,转染前(0小时)相比,无显著性差异；转染48小时细胞凋亡发生率较0小时明显增高；STAT3siRNA72小时后,凋亡发生率为12.0%,是0小时的4.8倍。A549细胞转染后48、72小时的G0/G1期细胞较0小时分别增加了16.5%,17.8%,同时S期细胞明显减少,由0小时的18.0%分别减至12.2%、10.0%结论：STAT3siRNA能够阻断肺腺癌细胞中STAT3信号通路,其抑制作用具有时间依赖性和高效特异性。STAT3siRNA能够抑制肺腺癌细胞的增殖,促进肺腺癌细胞凋亡。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R734.2
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
符号说明
第一部分 STAT3、p-STAT3在非小细胞肺癌组织中的表法及其与
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    附图
    参考文献
第二部分 非小细胞肺癌组织中STAT3信号与铅基因VEGF、VEGF-C、及MUC1关系的研究
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    附图
    参考文献
第三部分 STAT3、P-STAT3、VEGF、VEGF-C、及MUC1 与非小细胞肺癌预后的关系
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    附图
    参考文献
第四部分 STAT3 siRNA体外阻断人肺腺癌A549细胞系中STAT3信号通路活性的研究
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    附图
    参考文献
致谢
攻读学位期间发表的论文
论文一
论文二
论文三
附件

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 王彦敏;;血管生成因子VEGF研究进展[J];河北医药;2010年11期

2 李远航;;非小细胞肺癌组织中STAT3和磷酸化STAT3蛋白表达及临床意义[J];中外妇儿健康;2011年06期

3 王瑞娟;张建中;王萍;;磷酸化STAT3在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义[J];细胞与分子免疫学杂志;2012年03期

本文编号：2884685