Twist在促进胰腺癌血管生长中的作用

发布时间：2020-11-15 13:13

　　 目的:分析Twist在胰腺癌细胞株和胰腺癌组织中的表达,再通过体内外实验,观察上调和下调Twist对胰腺癌细胞新生血管形成的影响,并试图阐述Twist与VEGFA在胰腺癌中的相互关系,为基于靶向调控Twist在胰腺癌治疗中的应用提供有用的实验参考。方法:利用免疫组化和RT-PCR方法检测Twist和VEGFA在胰腺癌组织和胰腺癌旁正常组织中的表达,免疫组化分析胰腺癌组织中CD34的表达;利用慢病毒建立稳定过表达和沉默Twist的胰腺癌细胞株并检测稳转株中VEGFA和Twist蛋白的表达、细胞生长、细胞侵袭和其CM(conditioned medium,条件培养基)对体外人脐静脉内皮细胞(HUVECs)侵袭和血管新生的影响;利用沉默Twist及其对照的稳转胰腺癌细胞株建立人胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型,观察下调Twist对裸鼠胰腺肿瘤生长和转移情况,明胶-氧化铅血管造影法观察Twist对胰腺肿瘤血管生长的影响,免疫组化法检测Ki-67、CD34、VEGFA和Twist在两组胰腺肿瘤组织中的表达。结果:Twist和VEGFA在胰腺癌组织中的表达较正常胰腺组织明显升高,Twist mRNA的表达与胰腺癌临床病理分期相关,Twist和CD34以及VEGFA在胰腺癌组织中的表达均呈正相关;成功建立过表达Twist的稳转胰腺癌Capan-1细胞株和沉默Twist的稳转胰腺癌Bxpc-3细胞株,过表达Twist可促进VEGFA在Capan-1细胞中的表达,而沉默Twist可抑制VEGFA在Bxpc-3细胞中的表达;上调Twist在Capan-1细胞中的表达后,Capan-1细胞生长明显被促进,而下调Twist在Bxpc-3中的表达后可抑制体外Bxpc-3细胞增殖;过表达Twist可促进Capan-1细胞对体外HUVECs侵袭和血管新生诱导作用,而沉默Twist对上述作用产生抑制作用;下调Twist在胰腺癌细胞中的表达后可显著延长裸鼠生存期,抑制裸鼠胰腺肿瘤生长,并减少转移瘤数量;抑制Twist在胰腺癌中的表达可有效抑制体内胰腺癌组织血管生长,同时抑制Ki-67、CD34和VEGFA的阳性表达。结论:通过体内外实验证实Twist与胰腺癌新生血管生长关系密切,抑制Twist在胰腺癌细胞中的表达可有效抑制体内外胰腺癌细胞生长和血管新生,VEGFA和Twist可能在胰腺癌血管生长过程中起到协同作用,而Twist有望成为治疗胰腺癌新的作用靶点。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.9
【部分图文】：

个反应体系中的Ｃｔ值与初始ｍＲＮＡ表达量的对数值存在一定的线性关系，初始??表达量越多则Ｃｔ值越小。为此，通过已知初始表达量的标准品即可绘制标准曲??线（图１－２），横坐标表示为初始表达量的对数值，而Ｃｔ值代表为纵坐标，利??用目的基因的Ｃｔ值后再从标准曲线中即可计算出目的基因的初始表达量。??１７??

ｌａ?？?２２??Ｃｙｃｌｅ??图１－１：实时荧光定量ＰＣＲ反应扩增曲线图。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｌｏｔ．?Ｂａｓｅｌｉｎｅ－ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｖｅｒｓｕｓ?ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｃｙｃｌｅｓ．??荧光扩增曲线包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数倍增阶段、荧光信号??线性增长阶段及平台期这四个阶段。荧光背景信号阶段中的荧光背景信号将扩??增的荧光信号覆盖，从而难以准确获取目的基因表达量。线性期和平台期的目??的基因产物不再以指数式倍增，难以通过监测ＰＣＲ产物量反映初始ＤＮＡ表达??量，只有在荧光信号指数倍增阶段，ＰＣＲ产物量的对数值与起始模板量之间呈??线性关系。为了对这种线性关系进行分析，需要了解实时荧光定量ＰＣＲ反应中??的两个重要参数：荧光阈值和Ｃｔ值。前者是一个人为设定在任意荧光信号倍增??阶段上的值，一般将其设置在４－１２个循环的荧光信号的１２倍左右区间。Ｃｔ值??是指当反应管中的荧光信号到达预先设定的阈值时所发生的ＰＣＲ循环次数，每??个反应体系中的Ｃｔ值与初始ｍＲＮＡ表达量的对数值存在一定的线性关系，初始??表达量越多则Ｃｔ值越小。为此

Ｌｏｇ?Ｓｔａｒｔｉｎｇ?Ｑｕａａｔｉｆ／．ｃｃｐｙ?ｎｕｍｂｅｒ??令?ＳＹＢＲ?Ｅ＝?９９．９５Ｓ?ＲＡ２＝１．０００?ｓ＇ｏｐｅ＝－Ｓ．?３２４?＞－１〇１＝３４．?Ｓ７２??图１－２：实时荧光定量ＰＣＲ反应标准曲线图。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｉｎ?ｑＲＴ－ＰＣＲ．??１．２．１．２实验步骤??（１）
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本文编号：2884799