RAF激酶结合蛋白RUVBL1和HAX1在环境相关的肺癌发生中的作用机理研究

发布时间：2020-11-17 13:33

　　肺癌是全球也是中国发病率和死亡率最高的癌症,它也是云南省的“地方病”。非小细胞肺癌占肺癌总数的80%左右,存在易转移和易复发的特点,且对化疗不敏感。因此探索肺癌,特别是非小细胞肺癌的新的治疗靶点具有重要意义。肺癌是一种与环境高度相关的疾病,它与大气环境,室内环境污染有着密切联系。云南省的宣威和个旧地区因其地方矿产特点及生活习惯等问题,成为肺癌的高发区。肺癌还跟生活习惯,特别是吸烟有重要关系。遗传因素促成了肺癌的人群易感性。因此,肺癌是以环境因素为主,多种因素相互作用最终导致细胞内信号传导等发生异常而产生的癌症。RAF/MEK/ERK属于MAPK通路,它调控着细胞的生长,分化,转移,凋亡等诸多过程。作为该通路的重要节点蛋白RAF激酶在RAF/MEK/ERK通路中发挥重要的作用,RAF家族具有三个成员:A-RAF,B-RAF和C-RAF(RAF1)。B-RAF激酶突变与许多恶性肿瘤高度相关,RAF激酶异常的激活可促进下游ERK磷酸化增强,从而异常激活该信号通路,导致细胞出现异常分化增殖,促进了癌症的发生。因此,研究RAF激酶的调控机制显得格外重要。RAF激酶是RAF/MEK/ERK信号通路主干上的重要的枢纽蛋白,利用蛋白间的相互结合间接调控激酶功能是调控蛋白功能的重要方式,所以研究RAF激酶的结合蛋白也就成了研究RAF激酶调控的重要手段。B-RAF是RAF激酶家族的重要成员,其突变体V600E与包括肺癌在内的很多癌症的发生有关。针对B-RAF的抑制剂已经在临床开始应用,但是却存在靶点异常,耐药性等问题,为了解决这些问题,迫切需要发现新的,对RAF激酶具有更精准更单一的结合蛋白的出现。因此对于RAF激酶家族尤其是B-RAF功能调控的全面解析显得格外重要。本研究通过免疫共沉淀和多维质谱分析的方法,建立了B-RAF的结合蛋白谱,与已经明确的B-RAF结合蛋白比较后,得到了79个新的B-RAF结合蛋白,这些结合蛋白参与了很多细胞功能,覆盖了肿瘤的十大特征。系统分析B-RAF结合蛋白的功能与机制将会对B-RAF的功能研究有重要作用。结合实验室已有的C-RAF及A-RAF质谱分析数据,我们筛选了三个RAF激酶共同的结合蛋白RUVBL1和HAX1。RUVBL1,属于AAA+家族成员,参与多种细胞功能,与癌症的发生密切相关,但是其机制还不清楚。我们在A549细胞中敲除了RUVBL1蛋白,并进行了转录组测序,数据显示RUVBL1敲除后,许多基因表达发生了改变,这些差异基因的功能有30%左右集中在了RAF/MEK/ERK通路,提示我们该蛋白与MAPK通路有密切联系。因此我们针对该通路进行了后续研究。利用基因敲除细胞系,我们进行了肺癌细胞功能实验,发现该蛋白的缺失会影响A549细胞的增殖,迁移,干性,血管生成等,体内裸鼠成瘤实验也确认了RUVBL1的缺失可减弱A549成瘤能力。我们又进行了RUVBL1与RAF/MEK/ERK通路关系分析,发现RUVBL1敲除后,ERK磷酸化显著减弱,而A-RAF,B-RAF,C-RAF的表达水平无明显变化。B-RAF(245)的磷酸化程度也没有明显变化,而C-RAF serine 259磷酸化程度大大增强,作为抑制性磷酸化位点,RUVBL1可能通路调控C-RAF serine 259磷酸来调控C-RAF功能,进而调控RAF/MEK/ERK信号通路。HAX1,属于热休克蛋白结合蛋白,也参与多种细胞功能,同样与癌症的发生密切相关,而机制尚不清。我们也在A549细胞中敲除了HAX1蛋白,并行了转录组测序,数据显示HAX1敲除后,表达发生改变的基因较RUVBL1多,这些差异基因的功能有近20%左右集中在了RAF/MEK/ERK通路,提示我们该蛋白与MAPK通路有较为紧密的联系,同时有近10%的基因功能集中在凋亡通路。因此我们针对这两条通路进行了初步研究。利用基因敲除细胞系,我们进行了功能实验,发现该蛋白的缺失会影响A549细胞的增殖,迁移,干性,血管生成等,体内裸鼠成瘤实验也确认了HAX1的缺失也会减弱对A549成瘤能力。同时我们进行了多柔比星和依托泊苷的药物敏感型实验,发现HAX1敲除后可以提高A549细胞对这两种化疗药物的敏感性,尤其是多柔比星。于是,我们又进行了凋亡检测及动物实验,发现HAX1确实可以降低多柔比星的耐药性。接下来,我们又进行了RAF/MEK/ERK通路分析,发现HAX1敲除后,ERK磷酸化明显减弱,C-RAF serine 259磷酸化程度显著增强,同样,HAX1也能通过调控C-RAF serine 259磷酸来调控C-RAF功能,进而调控RAF/MEK/ERK信号通路。总之,我们从互作蛋白质组宏观水平探究了B-RAF结合蛋白的功能及对基因的调控,成功识别了79个新的B-RAF结合蛋白;也从微观水平探究了RAF激酶结合蛋白中RUVBL1和HAX1在肿瘤发生中的作用,初步确定RUVBL1和HAX1具有促进肺癌发生的作用;通过转录组分析及质谱分析,我们将RUVBL1和HAX1机制锁定在RAF/MEK/ERK通路研究,发现二者可以通过调控C-RAF serine 259磷酸化来调控C-RAF功能,进而调控RAF/MEK/ERK信号通路,RUVBL1和HAX1可能成为新的RAF激酶抑制剂,从而为临床治疗肺癌的提供新的研究靶标。
【学位单位】：昆明理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

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图 1.1 1930-2015 期间，美国男性肺癌死亡率居癌症首位Fig.1.1 Lung cancer mortality ranks first in cancer (male)during 1930-201the United States.1

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图 1.2 1930-2015 期间，美国女性肺癌死亡率居癌症首位Fig.1.2 Lung cancer mortality ranks first in cancer (female)during 1930-2015 in the United States.在我国，肺癌的发病率和死亡率也居于首位。据调查，2005 年我国新发肺癌人数为，2015 年为 70 万， 2017 年近 80 万，预计到 2025 年将达到 110 万。据一项癌症发

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