肝癌细胞中靶向调控Gab2蛋白的miRNA的初步研究
发布时间：2020-12-20 16:09
肝细胞癌（HCC）是全球最流行的恶性肿瘤之一,并且其高死亡率和高复发率一直是困扰临床治疗的难题。随着对HCC发展的分子机制和治疗耐药性认识的增强,临床研究者已经开发出许多分子靶向药物,并成为当前抗HCC药物研究的重点之一。这些药物可能靶向癌症发展中重要的一个或多个关键信号传导通路,例如细胞增殖,细胞凋亡和血管生成等。衔接蛋白Gab2作为支架分子,不仅在细胞异常增殖、侵袭、迁移等病理过程中发挥重要的作用,而且在信号转导中也扮演了重要的角色,使得其在人类癌症的发生、发展中所发挥的作用备受关注。本实验室过往的研究表明,Gab2在肝癌中的表达显著高于癌旁或正常组织细胞,并且过表达Gab2的肿瘤细胞的增殖,迁移及侵袭能力常常高于相应的癌旁或正常组织细胞。肝癌细胞中Gab2的高表达现象是由许多因素与调控机制共同作用形成的,而microRNA的调控表现的至关重要,并且异常表达的microRNA作为生物标志物可以用作HCC早期诊断以及预后治疗的分子靶点,因此我们对靶向调控Gab2蛋白的microRNA进行了探索。本课题利用生物信息学网站及软件对可能调控Gab2的microRNA进行预测,筛选出9个mi...
【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１．?Ｇａｂ２介导的细胞内信号传导途径??Ｆｉｇ．?１－１．?Ｇａｂ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ??
然后按照试剂盒所述配置反转录体系，如下：??ＲＮＡ?１?ｐ，ｇ??ＳｉｐｅｒＭｉｘ?ｆｏｒ?ｑＰＣＲ?４?ｊｊ．Ｌ??ＤＮＡ?ｒｅｍｏｖｅｒ?１?｜ｊ．Ｌ??ＲＮａｓｅ－Ｗａｔｅｒ?Ｍ?２０?｜ｉＬ??超纯水根据ＲＮＡ的体积调整补齐至２０?ｐＬ反应体系反复吹打混匀，再在??ＰＣＲ仪中４２?°Ｃ孵育３０分钟，８５?°Ｃ加热１０秒终止反应。??（２）?ｍｉＲＮＡ与普通ＲＮＡ的反转录有所不同。由于ｍｉＲＮＡ的长度太短，往往??小于ｑＰＣＲ引物的长度，用ｍＲＮＡ的反转录方法不利于引物结合并且容易引起??非特异性扩增，无法得到足以定量的ｃＤＮＡ。所以，ｍｉＲＮＡ的反转要求将其序??列进行延长。目前常用的序列延长反转录法包括茎环法和ｐｏｌｙＡ加尾法两种。其??原理如图２－１所示。??
图２－２．重叠延伸ＰＣＰ??Ｆｉｇ２－２．?Ｏｖｅｒｌａｐ?ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ?ＰＣＰ．??（１）引物Ｆ及Ｒ为原基因两端特异引物，其中Ｆｍ及Ｒｍ为设计中间引物，且??引物Ｆｍ及Ｒｍ中间共享一段序列（至少１５?ｂｐ左右碱基序列完全匹配），＊为突??变点。然后分别用引物？和！＾以及Ｆｍ和Ｒ相互配对进行普通ＰＣＲ扩增。此??夕卜，值得注意的是因为Ｔａｑ酶扩增容易造成产物移码突变，ＰＣＰ扩增时最好选择??Ｐ＆酶。??（２）回收第Ｉ步所得两条ＰＣＲ产物??（３）将第２步所得两份ＰＣＲ产物进行混合使其互为模板及引物，加入ｄＮＩＰ、??Ｐ＆酶及引物Ｆ和Ｒ进行普通ＰＣＲ扩增即可获得出定点突变的产物。??Ｈｓａ－ｍｉＲ－ｌ８ｌａ的结合位点有８个连续的碱基，ｈｓａ－ｍｉＲ－９的结合位点有８个??连续的碱基和７个不连续的碱基，我们根据重叠延伸ＰＣＲ的原理来设计引物将??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Nobuhiro Tsuchiya,Yu Sawada,Itaru Endo,Keigo Saito,Yasushi Uemura,Tetsuya Nakatsura. World Journal of Gastroenterology. 2015(37)
[2]Surgical treatment for liver cancer[J]. Nicole C Tsim,Adam E Frampton,Nagy A Habib,Long R Jiao. World Journal of Gastroenterology. 2010(08)
[3]Tumor vaccine against recurrence of hepatocellular carcinoma[J]. Bao-Gang Peng, Li-Jiang Liang, Qiang He, Ming Kuang, Jia-Ming Lia, Ming-De Lu, Jie-Fu Huang, Hepatobiliary Surgery Department, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2005(05)
本文编号：2928158
【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１．?Ｇａｂ２介导的细胞内信号传导途径??Ｆｉｇ．?１－１．?Ｇａｂ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ??
然后按照试剂盒所述配置反转录体系，如下：??ＲＮＡ?１?ｐ，ｇ??ＳｉｐｅｒＭｉｘ?ｆｏｒ?ｑＰＣＲ?４?ｊｊ．Ｌ??ＤＮＡ?ｒｅｍｏｖｅｒ?１?｜ｊ．Ｌ??ＲＮａｓｅ－Ｗａｔｅｒ?Ｍ?２０?｜ｉＬ??超纯水根据ＲＮＡ的体积调整补齐至２０?ｐＬ反应体系反复吹打混匀，再在??ＰＣＲ仪中４２?°Ｃ孵育３０分钟，８５?°Ｃ加热１０秒终止反应。??（２）?ｍｉＲＮＡ与普通ＲＮＡ的反转录有所不同。由于ｍｉＲＮＡ的长度太短，往往??小于ｑＰＣＲ引物的长度，用ｍＲＮＡ的反转录方法不利于引物结合并且容易引起??非特异性扩增，无法得到足以定量的ｃＤＮＡ。所以，ｍｉＲＮＡ的反转要求将其序??列进行延长。目前常用的序列延长反转录法包括茎环法和ｐｏｌｙＡ加尾法两种。其??原理如图２－１所示。??
图２－２．重叠延伸ＰＣＰ??Ｆｉｇ２－２．?Ｏｖｅｒｌａｐ?ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ?ＰＣＰ．??（１）引物Ｆ及Ｒ为原基因两端特异引物，其中Ｆｍ及Ｒｍ为设计中间引物，且??引物Ｆｍ及Ｒｍ中间共享一段序列（至少１５?ｂｐ左右碱基序列完全匹配），＊为突??变点。然后分别用引物？和！＾以及Ｆｍ和Ｒ相互配对进行普通ＰＣＲ扩增。此??夕卜，值得注意的是因为Ｔａｑ酶扩增容易造成产物移码突变，ＰＣＰ扩增时最好选择??Ｐ＆酶。??（２）回收第Ｉ步所得两条ＰＣＲ产物??（３）将第２步所得两份ＰＣＲ产物进行混合使其互为模板及引物，加入ｄＮＩＰ、??Ｐ＆酶及引物Ｆ和Ｒ进行普通ＰＣＲ扩增即可获得出定点突变的产物。??Ｈｓａ－ｍｉＲ－ｌ８ｌａ的结合位点有８个连续的碱基，ｈｓａ－ｍｉＲ－９的结合位点有８个??连续的碱基和７个不连续的碱基，我们根据重叠延伸ＰＣＲ的原理来设计引物将??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Nobuhiro Tsuchiya,Yu Sawada,Itaru Endo,Keigo Saito,Yasushi Uemura,Tetsuya Nakatsura. World Journal of Gastroenterology. 2015(37)
[2]Surgical treatment for liver cancer[J]. Nicole C Tsim,Adam E Frampton,Nagy A Habib,Long R Jiao. World Journal of Gastroenterology. 2010(08)
[3]Tumor vaccine against recurrence of hepatocellular carcinoma[J]. Bao-Gang Peng, Li-Jiang Liang, Qiang He, Ming Kuang, Jia-Ming Lia, Ming-De Lu, Jie-Fu Huang, Hepatobiliary Surgery Department, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2005(05)
本文编号：2928158
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