抗人肝癌干细胞功能性单抗的研究

发布时间：2017-04-13 11:53

  本文关键词：抗人肝癌干细胞功能性单抗的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率位居恶性肿瘤的第三位[1]。肿瘤治疗失败导致高死亡率的根本原因是转移、耐药和复发[2]。近年来的研究证明肿瘤干细胞在恶性肿瘤的转移、复发及耐药中发挥重要作用[3-4]。因此,靶向肿瘤干细胞的治疗新策略,有望降低肿瘤转移、复发及耐药,提高疗效,降低死亡率。 本研究首先选择转移能力不同的2株肝癌细胞系Be17402-V3和HepG2,采用无血清悬浮成球培养(sphere培养)具有自我更新能力的肿瘤干细胞。应用流式免疫荧光和细胞免疫荧光技术检测了PKH26、ESA、CD44、CD133、CD117等12种干细胞标志物,结果发现在Be17402-V3肝癌细胞系中ESA+和CD44+两种表型的细胞在sphere培养细胞中被明显富集,表明他们可能是肝癌干细胞。在HepG2细胞中,只有CD117+细胞可能是肝癌干细胞。采用流式荧光分选技术从2株肝癌细胞系中分别分选ESA+、CD44+及CD117+细胞经体外sphere培养,侵袭能力和耐药性测定以及裸鼠体内致瘤性检测等研究,发现ESA+细胞具有肿瘤干细胞自我更新能力、高侵袭性、高耐药性和在裸鼠体内高致瘤性的特征,是肝癌细胞系Be17402-V3中的肝癌干细胞,ESA是肝癌干细胞的标志物之一。用同样的技术首次在细胞系HepG2中也证明CD117+细胞是肝癌干细胞,CD117是肝癌干细胞的标志物之一。至此,我们成功地建立了肝癌干细胞的体内成瘤细胞模型,为研究抗人肝癌干细胞抗体奠定了重要基础。 在成功建立肝癌干细胞的细胞模型及体内成瘤模型的基础上,我们对前期筛选获得的抗人肝癌干细胞的2株单抗15D2和15B7进行了生物学特性及单抗靶向肝癌干细胞治疗肝癌的体内实验研究。首先采用双色免疫荧光及双色流式荧光检测的结果发现,15D2单抗能与肝癌干细胞标志物ESA、PKH26共染,表明该抗体识别的是肝癌干细胞。流式分选获得的15D2+细胞经体外sphere培养、侵袭性、耐药性及体内致瘤性检测分析,发现15D2+细胞与15D2细胞比较,具有高度自我更新、高耐药性和裸鼠体内高致瘤性的肿瘤干细胞特征,证明15D2单抗是抗肝癌干细胞的特异性单抗。体外功能研究结果显示,15D2单抗能显著抑制肝癌干细胞的增殖和迁移侵袭功能.抑制率分别达41.7%、35%和11.9%,表明15D2单抗是抗人肝癌干细胞的功能性抗体。15D2单抗靶向肝癌干细胞治疗肝癌的动物体内实验研究结果显示,接种肿瘤细胞2个月,停药1个月时,高、中、低剂量的15D2单抗治疗组抑制肝癌生长的抑制率分别为82.6%、71.4%和60%,单抗高剂量联合化疗药顺铂治疗的抑制率为91%,但单用化疗药顺铂的抑制率为56.7%,而且近3周单用化疗组肿瘤生长加快,显示肿瘤复发,这些结果表明抗肝癌干细胞单抗高剂量联合化疗组治疗效果显著优于单用化疗药,并略优于单用抗体组,表明15D2单抗靶向肝癌干细胞,不仅能明显抑制肿瘤生长,而且还能治疗肿瘤的复发和耐药,这些结果让我们看到靶向肿瘤干细胞治疗有望通过抑制肿瘤复发转移,突破耐药而减少死亡率延长生存期的希望。 采用同样的技术路线和方法,我们也证明了抗人肝癌干细胞单抗15B7是抑制识别人肝癌干细胞的单抗,15B7+细胞具有肝癌干细胞的高度自我更新、高侵袭等肿瘤干细胞的特征。体外功能研究也证明,15B7单抗能显著抑制肝癌干细胞的sphere增殖及成球生长,其抑制率分别达50.3%和32.4%抑制迁移侵袭的抑制率达7.8%,表明15B7单抗也是一株抗人肝癌干细胞的功能性单抗。
【关键词】：肝癌细胞系 肝癌干细胞 抗人肝癌干细胞功能性单抗 抗体靶向治疗
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 图表索引7-10
• 英文~.略词10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 文献综述15-23
• 前言23-26
• 材料与方法26-40
• 一、实验材料26-32
• 1.细胞26
• 2.动物26-27
• 3.主要试剂27-30
• 3.1 抗体27-28
• 3.2 常用试剂及材料28-30
• 4.主要仪器与设备30
• 5.计算机分析软件30-31
• 6.主要自配试剂及其配方31-32
• 二、实验方法32-40
• 1.肝癌细胞的培养32
• 1.1 人肝癌细胞系Bel7402-V3的传代与培养32
• 1.2 人肝癌细胞系HepG2的传代与培养32
• 2.肝癌干细胞相关亚群的无血清悬浮培养(sphere培养)32
• 3.杂交瘤细胞的培养32
• 4.PKH26染色32-33
• 5.流式细胞术分析或分选33
• 6.双色流式荧光分析或分选33-34
• 7.细胞免疫荧光34
• 8.双色细胞免疫荧光34
• 9.原位细胞免疫荧光34-35
• 10.免疫组织化学检测35
• 11.肝癌干细胞体外生物学特征的分析35-37
• 11.1 自我更新能力检测35
• 11.2 增殖能力检测35-36
• 11.3 耐药能力检测36
• 11.4 侵袭能力检测36-37
• 12.肝癌干细胞体内致瘤能力的分析37
• 13.抗肝癌干细胞单抗对肝癌干细胞生物学功能影响的分析37-38
• 13.1 抑制自我更新能力的检测37
• 13.2 抑制侵袭能力的检测37-38
• 13.3 抑制迁移能力的检测38
• 14.单抗靶向肝癌干细胞治疗肝癌的体内实验研究38
• 15.疏水层析纯化IgM抗体38-39
• 16.统计学分析39-40
• 第一部分 人肝癌干细胞的分离与鉴定40-65
• 一、前言40-42
• 二、实验结果42-61
• (一) 人肝癌细胞系Bel7402-V3中肿瘤干细胞的分离与鉴定42-54
• 1、PKH26染色检测肝癌干细胞42-43
• 2、流式荧光检测sphere细胞中肝癌干细胞的相关标志物43
• 3、双色流式荧光检测ESA~+CD44~+细胞在sphere细胞中的富集43-44
• 4、ESA~+CD44~+细胞的自我更新能力分析44-46
• 5、ESA~+CD44~+细胞的侵袭能力分析46-47
• 6、ESA~+CD44~+细胞的体内致瘤能力分析47-48
• 7、PKH26染色检测球形生长的肿瘤干细胞ESA的表达48-49
• 8、ESA~+细胞的自我更新能力分析49-50
• 9、ESA~+细胞的耐药能力分析50-52
• 10、ESA~+细胞的侵袭能力分析52-53
• 11、ESA~+细胞的致瘤能力分析53-54
• (二) 人肝癌细胞系HepG2肿瘤干细胞的分离鉴定54-61
• 1、sphere培养及PKH26染色检测肝癌千细胞54
• 2、流式荧光检测sphere细胞中肝癌干细胞的相关标志物54-55
• 3、细胞免疫荧光检测CD117~+细胞在sphere细胞中的富集55-56
• 4、CD117~+细胞的自我更新能力的检测分析56-57
• 5、CD117~+细胞体外增殖能力检测57-58
• 6、CD117~+细胞的耐药能力检测58-59
• 7、CD117~+细胞在SCID小鼠体内的成瘤能力分析59-61
• 三、讨论61-64
• 四、小结64-65
• 第二部分 抗肝癌干细胞单抗的研究65-93
• 一、前言65-69
• 二、实验结果69-88
• (一) 抗人肝癌干细胞单抗15D2的研究69-81
• 1、PKH26检测15D2单抗识别肝癌干细胞69-70
• 2、流式荧光检测15D2~+细胞在sphere细胞中的富集70
• 3、双色免疫荧光检测15D2识别ESA~+的肝癌干细胞70-71
• 4、双色流式荧光检测15D2和ESA双阳性细胞的比例71-72
• 5、15D2~+细胞的自我更新能力检测72-73
• 6、15D2~+细胞的耐药性分析73-74
• 7、15D2~+细胞的致瘤能力分析74-75
• 8、15D2单克隆抗体的纯化75
• 9、15D2单抗抑制肝癌干细胞增殖能力的比较75-76
• 10、15D2单抗抑制肝癌干细胞的侵袭能力76-77
• 11、15D2单抗抑制肝癌干细胞的迁移能力77-78
• 12、15D2单抗靶向肝癌干细胞治疗肝癌的体内实验研究78-81
• (二) 抗人肝癌干细胞单抗15B7的研究81-88
• 1、PKH26检测15B7单抗识别肝癌干细胞81
• 2、流式荧光检测15B7~+细胞在sphere细胞中的富集81-82
• 3、双色免疫荧光检测15B7识别ESA~+的肝癌干细胞82-83
• 4、流式双色细胞荧光检测15B7和ESA双阳性细胞的比例83
• 5、15B7~+细胞的自我更新能力检测83-84
• 6、15B7~+细胞的侵袭能力分析84-85
• 7、15B7单抗抑制sphere细胞的增殖能力85-86
• 8、15B7单抗抑制肝癌干细胞的自我更新能力86
• 9、15B7单抗抑制肝癌干细胞的侵袭能力86-88
• 三、讨论88-91
• 四、小结91-93
• 参考文献93-99
• 致谢99-100
• 攻读学位期间发表的论文100

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