LIN28A在浸润性乳腺癌中的表达调控及其功能机制的研究

发布时间：2017-04-13 20:00

  本文关键词：LIN28A在浸润性乳腺癌中的表达调控及其功能机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,我国乳腺癌的发病率以每年3%的速度递增,成为威胁女性最常见的恶性肿瘤。上皮细胞-间充质转化(EMT)是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。LIN28作为高度保守的RNA结合蛋白,在多种肿瘤中存在广泛的异位表达,且有研究发现,LIN28过度表达是肿瘤患者不良预后的强大预测指标。本文通过研究LIN28A在浸润性乳腺癌中的表达以及LIN28A对乳腺癌细胞的影响,探讨LIN28A诱导乳腺癌发生EMT以及对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡调控机制。方法:1 首先利用实时定量PCR对浸润性乳腺癌组织中LIN28A、OCT4、E-cadherin和Vimeatin进行检测,明确它们的表达情况,其次利用免疫组织化学法,分析LIN28A的表达与临床病理参数之间的关系,以期明确在浸润性乳腺癌中LIN28A与EMT相关因子及OCT4的关系,最后通过TUNNEL实验检测石蜡组织切片中细胞凋亡的情况,探究LIN28A对细胞凋亡的影响。2 体外实验通过构建稳定表达LIN28A的MCF-7细胞系,研究LIN28A对乳腺细胞特性的影响,其中包括流式细胞术检测病毒转染效率,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力,克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期情况。最后,通过Real-time和Western-blot实验检测各相关基因及蛋白的表达情况,明确乳腺癌细胞中LIN28A对癌细胞的调控机制。结果:1 Real-time实验结果显示,与癌旁组织相比,在浸润性乳腺癌组织中LIN28A、OCT4、Vimeatin高表达,E-cadherin低表达。并且LIN28A与OCT4表达正相关(R=0.332,P0.05),Vimeatin表达正相关(R=0.38,P0.05),与E-cadherin表达负相关(R=-0.34,P0.05),E-cadherin与Vimeatin表达也成负相关(R=-0.353,P0.05);2免疫组织化学实验表明,LIN28A表达与浸润性乳腺癌肿瘤的大小、病理分期、分级、淋巴结转移和远处转移有关,差异有统计学意义(P0.05)。并且LIN28A与OCT4表达正相关(R=0.423,P0.05),与Vimeatin表达正相关(R=0.364,P0.05),与E-cadherin表达负相关(R=-0.533,P0.05),E-cadherin与Vimeatin表达也成负相关(R=-0.453,P0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析表明,患者低LIN28A表达水平存活显著长于那些高LIN28A表达水平,差异有统计学意义(P=0.021),表明,在浸润性乳腺癌中,LIN28A与患者的不良临床预后相关;3 TUNNEL实验显示,高表达LIN28A的乳腺癌组织中,细胞凋亡减少;4 Puromycin筛选出稳定表达LIN28A的MCF-7细胞株,流式细胞术检测转感染率,用400μl病毒液感染293T细胞,control-p SBbi-GP和LIN28A-p SBbi-GP的感染效率为13.1%、12.6%。800μl病毒液感染293T细胞,control-p SBbi-GP和LIN28A-p SBbi-GP的感染效率为20.1%、19.5%。由于转染效率太低,故用病毒原液感染MCF-7细胞,control-p SBbi-GP和LIN28A-p SBbi-GP的感染效率为29.6%、24.8%。;5用Real-time和Western-blot检测稳转后LIN28A的表达情况,首先Real-time检测LIN28A和let-7a的表达,从实验结果可以看出,与control-p SBbi-GP和parental相比,LIN28A-p SBbi-GP中LIN28A mRNA表达升高,而let-7a mRNA表达降低(P0.05)。随后通过Western-blot实验检测LIN28A蛋白水平的表达,同样是与control-p SBbi-GP和parental相比,LIN28A-p SBbi-GP中LIN28A表达升高(P0.05);6克隆形成实验研究细胞增殖的变化,本实验结果显示,parental组、control-p SBbi-GP组和LIN28A-p SBbi-GP组的克隆数分别为38.20±2.02、44.55±2.67和102.65±9.87,与parental组和control-p SBbi-GP组相比,LIN28A-p SBbi-GP克隆数显著增加(P0.05),control-p SBbi-GP组与parental组相比,差异无统计学意义(P0.05),提示过表达LIN28A基因可以促进细胞增殖;7 Transwell实验结果显示,在乳腺癌MCF-7细胞中,与parental组和control-p SBbi-GP组相比,LIN28A-p SBbi-GP组迁移和侵袭到下室的细胞数明显增加(P0.05),提示过表达LIN28A基因可以促进细胞的迁移和侵袭能力;8 FCM检测细胞凋亡和细胞周期的变化,结果显示,与parental组和control-p SBbi-GP组相比,LIN28A-p SBbi-GP组细胞早期凋亡率显著降低(P0.05),并且,过表达LIN28A基因后,G1期细胞减少,S期细胞增多;9 Real-time和Western-blot实验结果表明,与parental组和control-p SBbi-GP组相比,LIN28A-p SBbi-GP组MCF-7细胞Snail和Slug表达上调,Cyclin D1和e IF4E表达上调,Bcl-XL表达上调,这表明过表达LIN28A可能通过抑制let-7诱导乳腺癌细胞增殖,抑制细胞凋亡;10进一步研究LIN28A与OCT4的关系,通过Real-time和Western-blot实验发现,过表达LIN28A后,OCT4表达增加,E-cadherin表达减少,Vimtern表达增加,提示,LIN28A也可以通过诱导OCT4的表达,促进乳腺癌EMT的进程。结论:1 LIN28A在浸润性乳腺癌中的表达与E-cadherin的表达负相关与Vimentin的表达正相关,提示LIN28A可能通过EMT促进了乳腺癌的发生、发展和转移,并且LIN28A高表达是患者不良预后的独立因素。2 通过慢病毒转染技术在MCF-7细胞中过表达LIN28A,我们发现LIN28A过表达可促进细胞的增殖,抑制细胞的凋亡,使细胞阻滞在S期,同时,通过检测let-7相关的靶基因,发现LIN28A可以通过LIN28/Let-7/HMGA2/Slug、Snail/E-cadherin和LIN28/let-7/BCL-XL途径,促进乳腺癌细胞细胞的增殖,抑制细胞凋亡,此外,结合先前的研究,我们通过Real-time和Western-blot实验发现,过表达LIN28A后,OCT4表达增加,E-cadherin表达减少,Vimtern表达增加,提示,LIN28A也可以通过诱导OCT4的表达,促进乳腺癌EMT的进程。为乳腺癌的治疗提供了新的靶点。
【关键词】：浸润性乳腺癌 LIN28A 上皮-间充质转化 细胞转染 OCT4 肿瘤干细胞
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 引言11-13
• 第一部分 LIN28A在乳腺癌组织中的表达及其与临床病理的关系13-34
• 前言13-15
• 材料与方法15-22
• 结果22-23
• 附图23-27
• 附表27-29
• 讨论29-31
• 小结31-32
• 参考文献32-34
• 第二部分 LIN28A对乳腺癌细胞生物学行为的影响及其机制的研究34-66
• 前言34-36
• 材料与方法36-48
• 结果48-50
• 附图50-58
• 附表58-60
• 讨论60-62
• 小结62-63
• 参考文献63-66
• 综述 LIN28/let-7对恶性肿瘤的调节66-79
• 参考文献73-79
• 致谢79-80
• 个人简历80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Ting-Ting Li;Shuji Ogino;Zhi Rong Qian;;Toll-like receptor signaling in colorectal cancer:carcinogenesis to cancer therapy[J];World Journal of Gastroenterology;2014年47期

  本文关键词：LIN28A在浸润性乳腺癌中的表达调控及其功能机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：304331