慢病毒介导的shRNA干扰人C1GALT1胃癌稳定细胞株的建立及其生物学特性
发布时间：2021-04-10 12:16
目的:构建特异的靶向人C1GALT1基因的RNA干扰（RNAinterference,RNAi）慢病毒载体,建立C1GALT1基因稳定沉默的胃癌MGC803细胞株。对慢病毒介导的shRNA靶向干扰C1GALT1胃癌MGC803稳定细胞株生物学特性进行初步观察,检测沉默C1GALT1基因表达对MGC803细胞增殖、迁移、侵袭、周期、凋亡功能的影响。方法:1.设计C1GALT1基因的特异性shRNA靶点,构建pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1干扰慢病毒包装载体,包装慢病毒并侵染MGC803细胞,构建C1GALT1基因稳定沉默的胃癌MGC803细胞株。用转染空载体的稳转细胞作为阴性对照。采用qPCR方法检测MGC803细胞中C1GALT1的mRNA水平变化,Western Blot方法检测C1GALT1蛋白水平的表达,以鉴定C1GALT1基因沉默的效果。2.采用CCK8增殖实验、细胞划痕实验、Transwell实验、流式细胞术检测C1GALT1基因沉默后对胃癌MGC803细胞的增殖、迁移、侵袭、周期、凋亡能力的影响。结果:1.成功构建了特异...
【文章来源】：南华大学湖南省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
h-C1GALT1shRNA1测序结果比对图(绿色区域为与目的序列匹配部分）
17第三章实验结果3.1pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1重组质粒的构建和测序鉴定将siRNA1单链的引物退火，再连接入双酶切线性化的RNA干扰载体(pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO)中，挑选菌落送至测序公司进行测序，测序结果正确（见图3.1，3.2），证明构建pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1重组质粒成功。图3.1h-C1GALT1shRNA1测序结果比对图(绿色区域为与目的序列匹配部分）图3.2测序峰图3.2pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1慢病毒感染MGC803细胞及构建稳定沉默细胞系将pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1慢病毒感染人胃癌MGC803细胞，并添加助感染试剂增加感染率，再进行C1GALT1基因稳定沉默的胃癌MGC803细胞的单克隆培养，使用Puromycin筛选感染细胞,然后对其放大培养，用倒置荧光显微镜观察细胞呈现出绿色荧光，表明稳定感染的细胞株构建成功。
18单克隆MGC803-h-C1GALT1干扰扩大培养后的荧光图，选取1个视野进行荧光和白光拍照，结果如下：见图3.3。图3.3MGC-803细胞系中沉默C1GALT1表达的细胞株（×20）3.3ReRlRRmePCR法检测C1GALT1表达结果C1GALT1基因稳定沉默细胞系MGC-803中经过单克隆培养及筛选最终挑取MGC803-sh-C1GALT1-1、MGC803-sh-C1GALT1-2、MGC803-sh-C1GALT1-3这3株细胞，和空载体组细胞（MGC-803-NC）一共4株分别进行RNA提取，利用紫外分光光度计其质量，见表3.1。使用实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应并绘制溶解曲线及扩增曲线，GAPDH和h-C1GALT1溶解曲线较好，证明RNA抽提和QPCR过程无问题，见图3.4、3.5。C1GALT1基因稳定沉默组的C1GALT1的mRNA比阴性对照组明显降低（p＜0.05），h-C1GALT1在MGC-803细胞中有干扰效果，其中C1GALT1-shRNA1单克隆3干扰下调73%，见图3.6。表3.1紫外分光光度计检测RNA提取质量检测结果样品名称OD260/OD280OD260/OD230RNA浓度(ng/uL)MGC-803-NC1.911.99546sh-C1GALT1-11.891.96560sh-C1GALT1-21.861.94551sh-C1GALT1-31.881.95544
【参考文献】：
期刊论文
[1]Long noncoding RNA HOXA11-AS promotes gastric cancer cell proliferation and invasion via SRSF1 and functions as a biomarker in gastric cancer[J]. Yun Liu,Yu-Mei Zhang,Feng-Bo Ma,Su-Rong Pan,Bao-Zhen Liu. World Journal of Gastroenterology. 2019(22)
[2]Prognostic significance of preoperative and postoperative CK19 and CEA m RNA levels in peripheral blood of patients with gastric cardia cancer[J]. Yu-Feng Qiao,Chuan-Gui Chen,Jie Yue,Ming-Quan Ma,Zhao Ma,Zhen-Tao Yu. World Journal of Gastroenterology. 2017(08)
[3]New advances in targeted gastric cancer treatment[J]. Daniela Cornelia Laz?r,Sorina T?ban,Marioara Cornianu,Alexandra Faur,Adrian Goldi?. World Journal of Gastroenterology. 2016(30)
[4]Nitrosamine and related food intake and gastric and oesophageal cancer risk: A systematic review of the epidemiological evidence[J]. Paula Jakszyn,Carlos Alberto González. World Journal of Gastroenterology. 2006(27)
本文编号：3129623
【文章来源】：南华大学湖南省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
h-C1GALT1shRNA1测序结果比对图(绿色区域为与目的序列匹配部分）
17第三章实验结果3.1pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1重组质粒的构建和测序鉴定将siRNA1单链的引物退火，再连接入双酶切线性化的RNA干扰载体(pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO)中，挑选菌落送至测序公司进行测序，测序结果正确（见图3.1，3.2），证明构建pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1重组质粒成功。图3.1h-C1GALT1shRNA1测序结果比对图(绿色区域为与目的序列匹配部分）图3.2测序峰图3.2pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1慢病毒感染MGC803细胞及构建稳定沉默细胞系将pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1慢病毒感染人胃癌MGC803细胞，并添加助感染试剂增加感染率，再进行C1GALT1基因稳定沉默的胃癌MGC803细胞的单克隆培养，使用Puromycin筛选感染细胞,然后对其放大培养，用倒置荧光显微镜观察细胞呈现出绿色荧光，表明稳定感染的细胞株构建成功。
18单克隆MGC803-h-C1GALT1干扰扩大培养后的荧光图，选取1个视野进行荧光和白光拍照，结果如下：见图3.3。图3.3MGC-803细胞系中沉默C1GALT1表达的细胞株（×20）3.3ReRlRRmePCR法检测C1GALT1表达结果C1GALT1基因稳定沉默细胞系MGC-803中经过单克隆培养及筛选最终挑取MGC803-sh-C1GALT1-1、MGC803-sh-C1GALT1-2、MGC803-sh-C1GALT1-3这3株细胞，和空载体组细胞（MGC-803-NC）一共4株分别进行RNA提取，利用紫外分光光度计其质量，见表3.1。使用实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应并绘制溶解曲线及扩增曲线，GAPDH和h-C1GALT1溶解曲线较好，证明RNA抽提和QPCR过程无问题，见图3.4、3.5。C1GALT1基因稳定沉默组的C1GALT1的mRNA比阴性对照组明显降低（p＜0.05），h-C1GALT1在MGC-803细胞中有干扰效果，其中C1GALT1-shRNA1单克隆3干扰下调73%，见图3.6。表3.1紫外分光光度计检测RNA提取质量检测结果样品名称OD260/OD280OD260/OD230RNA浓度(ng/uL)MGC-803-NC1.911.99546sh-C1GALT1-11.891.96560sh-C1GALT1-21.861.94551sh-C1GALT1-31.881.95544
【参考文献】：
期刊论文
[1]Long noncoding RNA HOXA11-AS promotes gastric cancer cell proliferation and invasion via SRSF1 and functions as a biomarker in gastric cancer[J]. Yun Liu,Yu-Mei Zhang,Feng-Bo Ma,Su-Rong Pan,Bao-Zhen Liu. World Journal of Gastroenterology. 2019(22)
[2]Prognostic significance of preoperative and postoperative CK19 and CEA m RNA levels in peripheral blood of patients with gastric cardia cancer[J]. Yu-Feng Qiao,Chuan-Gui Chen,Jie Yue,Ming-Quan Ma,Zhao Ma,Zhen-Tao Yu. World Journal of Gastroenterology. 2017(08)
[3]New advances in targeted gastric cancer treatment[J]. Daniela Cornelia Laz?r,Sorina T?ban,Marioara Cornianu,Alexandra Faur,Adrian Goldi?. World Journal of Gastroenterology. 2016(30)
[4]Nitrosamine and related food intake and gastric and oesophageal cancer risk: A systematic review of the epidemiological evidence[J]. Paula Jakszyn,Carlos Alberto González. World Journal of Gastroenterology. 2006(27)
本文编号：3129623
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