Syncytin基因异常表达细胞系构建和白血病动物模型的建立

发布时间：2017-04-21 17:10

  本文关键词：Syncytin基因异常表达细胞系构建和白血病动物模型的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人内源性逆转录病毒(human endogenous retroviruses,HERV)是生物进化过程中远古逆转录病毒感染人类基因组,继而通过孟德尔遗传方式被后代遗传留下的遗迹。HERV至少可分为31个家族,而研究最多的是HERV-K、ERV-H、 HERV-W三个家族。其中Syncytin是HERV-W基因编码的囊膜蛋白,由538个氨基酸组成。本研究小组在研究中发现在8个白血病或淋巴瘤细胞系中syncytin mRNA和syncytin蛋白均有不同程度的表达,并且syncytin基因的表达水平与白血病患者病情相关。通过用密度梯度离心法分离患者及正常对照的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),利用自制的抗体检测白血病患者细胞膜上的表达。证实了syncytin蛋白在白血病细胞系以及部分患者外周血细胞膜有表达。白血病对人类的生命和健康造成了极大的威胁,是国内10个高发的一类造血干细胞克隆性的恶性肿瘤,其男性的发病率高于女性,且35岁以下人群发病率的死亡率最高。从白血病的发现至今,我们还没用完全清楚白血病复杂的病因与发病机制。白血病的发病主要与遗传因素,病毒因素,染色体及免疫功能遗传有关。20世纪70年代以来白血病实验研究的新发展是利用免疫缺陷动物做白血病动物模型,从而研究人类白血病细胞的发生、发展、分子机制及其生物学特性,进而用来进行实验治疗,寻求诊断白血病新的靶点。小鼠造血系统特点与人类十分相似,同时近交系动物基因纯合度高,遗传背景均一,易于控制,重复性好。因此,选择近交系小鼠构建syncytin基因异常表达小鼠白血病动物模型更能近似反映人体的实际情况。能够为研究syncytin基因在白血病发生机制中所起的作用和解析syncytin基因如何参与白血病分子机理以及靶向基因治疗的研究提供一个较为理想的模型。本实验采用lipofectamine 2000 Reagent将syncytin过表达载体转染到EL4细胞和293T细胞,转染48 h后荧光倒置显微镜下观察,只在293T细胞空载体发现荧光,经Western Blot和RT-PCR检测,过表达组Syncytin蛋白和基因相对表达量明显高于对照组,表明过表达载体有效可用。利用Lenti-Pac HIV慢病毒包装Syncytin表达质粒,感染EL4细胞,用含有嘌呤霉素的培养基进行阳性筛选,获得稳定表达syncytin的细胞株。经Western Blot检测,过表达syncytin细胞组的syncytin/β-Actin灰度比值明显高于对照组；QPCR检测稳定表达细胞mRNA表达结果显示只有过表达syncytin细胞有相对高的表达量。上述实验揭示了稳定表达Syncytin蛋白的syncytin-EL4细胞系构建成功。本实验同时用低表达syncytin的Jurkat细胞系做小鼠白血病动物模型预实验。选用C57BL/6小鼠,供鼠为雄鼠,受鼠为雌鼠。骨髓移植前6天给与含硫酸庆大霉素(0.004ml/只)无菌水喂养,持续至移植后2周。前7天进行消洗宝液(0.1g/L)药浴,前三天开始所有小鼠每天一次分别经尾静脉注射环磷酰胺(CTX),注射量为100mg/kg。前2天将(1-2)×106各组细胞0.5m1经尾静脉接种至C57BL/6小鼠。骨髓移植后观察发现各组小鼠的体重情况变化均幅度不大,小鼠多运动,精神状态较好。两周后小鼠尾尖取血涂片观察,对照组(EL4细胞组)和实验组(syncytin低表达细胞组)中的原始细胞的比例没有显著性的差异(P0.05)综上所述,本实验成功建立了稳定表达Syncytin蛋白的syncytin-EL4细胞系,为下一步建立稳定表达syncytin-EL4细胞系小鼠白血病动物模型和分析研究syncytin与白血病免疫逃逸机制提供了细胞模型。小鼠白血病动物模型的预实验间接证实了低表达syncytin的Jurkat细胞系可能在培养过程中出现syncytin基因不表达或缺失,猜想syncytin在低表达syncytin田胞中的表达在细胞多次传代后受到其他基因的抑制。该动物模型的建立为后续的syncytin-EL4稳定表达细胞系小鼠白血病动物模型的建立提供了更明确的实验方法,从而为揭示syncytin在小鼠白血病发生的机制研究奠定基础的一步。
【关键词】：人内源性逆转录病毒 白血病 syncytin 动物模型 骨髓移植 QPCR
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7;R-332
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-17
• 缩略表17-18
• 第一章 绪论18-32
• 1.1 人类内源性逆转录病毒18-19
• 1.2 HERVS分类19-20
• 1.3 HERV的结构与分布20-21
• 1.4 HERV的生物学功能21-22
• 1.4.1 编码基因的表达21
• 1.4.2 对其他基因的顺势调控作用21-22
• 1.4.3 HERV元件的相互作用22
• 1.4.4 其他作用22
• 1.5 HERV与肿瘤22-24
• 1.6 HERV-W家族24-27
• 1.6.1 HERV-W24
• 1.6.2 Syncytin与白血病24-27
• 1.7 小鼠白血病模型27-28
• 1.7.1 近交系小鼠28
• 1.7.2 突变系小鼠28
• 1.8 研究内容28-32
• 1.8.1 稳定表达syncytin EL4细胞系的构建29-30
• 1.8.2 Syncytin基因异常表达小鼠动物模型的建立30-32
• 第二章 稳定表达syncytin EL4细胞系的构建32-70
• 2.1 实验试剂溶液、耗材、仪器32-36
• 2.1.1 试剂溶液32-35
• 2.1.2 耗材35
• 2.1.3 仪器35-36
• 2.2 Syncytin过表达载体构建36-43
• 2.2.1 载体的构建36-40
• 2.2.2 STBL3菌种扩增培养40
• 2.2.3 STBL3感受态细胞制作40-41
• 2.2.4 载体转化41
• 2.2.5 转化扩增培养后单克隆挑取及扩大培养41
• 2.2.6 hLUC慢病毒载体提取41-42
• 2.2.7 质粒浓度测定及琼脂糖凝胶电泳42-43
• 2.2.7.1 质粒浓度测定42
• 2.2.7.2 电泳检测42-43
• 2.2.8 结果43
• 2.2.8.1 浓度测定43
• 2.2.8.2 凝胶电泳图43
• 2.3 载体转化、扩增、提取43-44
• 2.4 载体测序44-47
• 2.5 质粒转染EL4细胞47-49
• 2.5.1 EL4细胞培养47-48
• 2.5.2 转染48-49
• 2.6 Western Blot检测质粒的有效性49-55
• 2.6.1 抗体和溶液的配置49-50
• 2.6.2 细胞总蛋白的提取与变性50
• 2.6.3 用BCA蛋白定量试剂盒测定样品中蛋白含量50-52
• 2.6.4 制胶52-53
• 2.6.5 蛋白变性53
• 2.6.6 电泳53
• 2.6.7 转膜53
• 2.6.8 封闭和孵育抗体53-54
• 2.6.9 显影54
• 2.6.10 实验结果及分析54-55
• 2.7 慢病毒包装质粒转染EL4后的RT-PCR检测55-58
• 2.7.1 Trizol法提取细胞总RNA55
• 2.7.2 RNA逆转录及总RNA浓度测定55-56
• 2.7.3 RT-PCR检测56-57
• 2.7.4 RT-PCR结果57-58
• 2.8 筛选Syncytin-EL4稳定表达细胞株58-60
• 2.8.1 慢病毒包装58-59
• 2.8.2 Syncytin慢病毒感染EL4细胞59
• 2.8.3 筛选Syncytin-EL4稳定表达细胞株的筛选59-60
• 2.9 WB和QPCR检测syncytin-EL4稳定表达细胞60-69
• 2.9.1 WB检测稳定表达细胞表达蛋白表达60-64
• 2.9.1.1 细胞总蛋白的提取与变性(所有的操作均要在冰上进行)61
• 2.9.1.2 用BCA蛋白定量试剂盒测定样品中蛋白含量61-62
• 2.9.1.3 电泳、转膜、孵育抗体及显影62-64
• 2.9.1.4 实验结果及分析64
• 2.9.2 PCR检测稳定表达细胞mRNA表达64-69
• 2.9.2.1 实验中主要试剂的配制64-65
• 2.9.2.2 引物65
• 2.9.2.3 标本的处理65
• 2.9.2.4 总RNA的提取65-66
• 2.9.2.5 RNA质量检测66
• 2.9.2.6 逆转录合成cDNA66-67
• 2.9.2.7 定量PCR检测67-69
• 2.10 本章实验小结69-70
• 第三章 Syncytin基因异常表达小鼠白血病动物模型的建立70-80
• 3.1 实验试剂、耗材、仪器71-72
• 3.2 Syncytin基因异常表达小鼠动物模型的建立72-78
• 3.2.1 小鼠骨髓移植前处理72
• 3.2.2 小鼠骨髓移植(BMT)分组72
• 3.2.3 BMT后的观察72-73
• 3.2.4 实验结果与分析73-78
• 本章小结78-80
• 第四章 结论80-82
• 致谢82-84
• 参考文献84-88
• 附录A88
• 附录B88

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