抗CD19的嵌合抗原受体T细胞体内杀瘤活性及安全性研究
发布时间：2021-06-01 05:54
[研究目的]嵌合抗原受体 T 细胞（Chimeric Antigen Receptor T Cell,CAR-T）疗法是一种通过对T细胞进行基因改造来实现肿瘤靶向杀伤的免疫治疗技术。目前CAR-T细胞在治疗血液系统肿瘤方面已经取得了很好的疗效。但是在CAR-T细胞制备的过程中CAR基因导入的方法主要是病毒转染。在病毒转染的过程中,无论是制备成本、致病性还是潜在的插入诱变可能性都在临床应用中存在着显著的监管障碍。本实验室自主构建的人工抗原提呈细胞（Artificial antigen presenting cell,aAPC）能够作为饲养细胞于体外特异性刺激CAR-T细胞的增殖,不仅提高了扩增效率,还能够减少外源细胞因子及磁珠的使用量,降低实验成本,可大幅减轻临床患者的经济负担。为了避免病毒转染体系的不足之处,本实验中所应用的CAR-T细胞是通过piggyBac转座子转化体系所转染,并由aAPC于体外刺激培养所制备的。因此本实验的目的是研究转座子转化体系制备并由aAPC刺激增殖这一新的制备体系下生产的CAR-T细胞其体内杀瘤活性及安全性。作为临床前实验,充分证明该培养体系下制备的CAR-...
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＮＡＭＡＬＷＡ小鼠（ＳＣＩＤ）移植瘤模型处理流程??
ＣＡＲ－Ｔ细胞体内杀瘤活性验证处理流程图??腹腔注射两次?邏制生??＾??１??＼＼???）?？?？?????????？??夭?〇?３?１０?１７?２４?３１?３２??＞ａｍ?ａｈｖａ细跑尾靜财注射??图１－１?ＮＡＭＡＬＷＡ小鼠（ＳＣＩＤ）移植瘤模型处理流程??ＣＡＲ－Ｔ细胞体内杀瘤活性验证处理流程图??＝次?小鼠挪麵麵識■ＩＪＳＩ??ｉ?ｌ－＾Ｈ??＼＊?＾??／?？?？?？?ｍ?？?？??＾?０?３?１０?１７?２４?３２??Ｒ＞湖腿静赃射??图１－２?Ｒａｊｉ细胞小鼠（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）移植瘤模型处理流程??２．４实验方法??２．４．１常规试剂的配方??１６４０完全培养基（１０％血清）：ＲＰＭＩ－１６４０培养液，置于４°Ｃ保存，临用前溶化??后加入１０％胎牛血清、１００Ｕ／ｍｌ青霉素和链霉素和０．２５ｎｇ／ｍｌ可溶性两性霉素Ｂ。??１６４〇完全培养基（２０％血清）：ＲＰＭＩ－１６４０培养液，置于４°Ｃ保存，临用前溶化??后入２０％胎牛血清，］００Ｕ／ｍｌ青霉素和链霉素，０．２５略／ｍｌ可溶性两性霉素Ｂ。??ＰＢＳ?缓冲液：８ｇＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、１．４４ｇＮａ２ＨＰ〇４?和?０．２４ｇＫＨ２Ｐ〇４，溶于?８００ｍｌ??蒸馏水中，用盐酸调节溶液的ｐＨ值至７．４，最后加蒸馏水定容至１Ｌ。在１３４°??Ｃ（１．０３４Ｘ?ｌ〇５Ｐａ）高压下蒸气灭菌２０分钟，保存存于室温或４°Ｃ冰箱中。??流式细胞术细胞清洗液：ｌｇＢＳＡ溶于ｌＯＯｍｌＰＢＳ，用０．４５?ｕｍ滤网过滤除菌后放??置４°Ｃ冰箱中保存。??１４??
二、结果??３．１?ＮＡＭＡＬＷＡ细胞模型小鼠体内肿瘤细胞分布情况??为了检测ＳＣＩＤ小鼠体内肿瘤细胞的分布及数量情况，在小鼠麻醉后向其腹??腔内注射Ｂｅｅｔｌｅ?Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ?Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ?Ｓａｌｔ甲虫焚光素钾盐。向小鼠体内注射的??ＮＡＭＡＬＷＡ细胞内含有人工转入的荧光素酶报告基因能够产生荧光素酶蛋白，??当其与小分子底物焚光素Ｂｅｅｔｌｅ?Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ?Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ?Ｓａｌｔ甲虫焚光素钾盐结合时??在氧、Ｍｇ２＋离子存在的条件下消耗ＡＴＰ发生氧化反应，将部分化学能转变为可??见光释放，从而被ＩＶ丨Ｓ?Ｓｐｅｃｔｒｕｍ?Ｓｙｓｔｅｍ小动物活体成像系统记录，通过比较不??同时间内小鼠体内肿瘤细胞发光情况的动态变化，从而分析推测出小鼠体内肿瘤??细胞的分布情况。通过小鼠活体荧光成像的结果可以发现注射进小鼠体内的??ＮＡＭＡＬＷＡ细胞能够稳定生存并不断进行增殖和扩散，见图１－３，１－４。该模型肿??瘤移植成功率达到１００％。并且在整个实验过程中未发生肿瘤自行消退现象。??…。關叫??ｌｌｌｌ；??ｄ?３麵醜Ｌ??图１－３活体荧光成像监测体内肿瘤细胞分布情况??２０??
【参考文献】：
期刊论文
[1]实体肿瘤免疫治疗的关键问题与对策[J]. 刘宝瑞. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2017(06)
[2]CAR-T细胞治疗实体瘤的挑战与思考[J]. 刘洋,朱宏丽,韩为东. 中国肿瘤临床. 2017(09)
[3]嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在常见儿童肿瘤治疗领域中的应用[J]. 史沛杰,方建培. 中国小儿血液与肿瘤杂志. 2017(01)
[4]消化系统恶性肿瘤血管正常化的研究进展[J]. 李隆敏,许桐瑛,朱文婷,谢蕊,周庆鑫,白玉贤. 中国肿瘤. 2016(12)
[5]CAR-T治疗恶性肿瘤的研究进展及趋势分析[J]. 刘永军,于雪蕾,张军华. 免疫学杂志. 2016(11)
[6]脂质体法与电穿孔法转染两种细胞效率的比较[J]. 张禾璇,单可人,何燕,张婷,王婵娟,官志忠. 重庆医学. 2014(33)
[7]淋巴瘤实验动物模型构建的研究与应用[J]. 熊豫麟,张远旭,黄云超,杨世华. 广东医学. 2014(09)
[8]苯乙酸联合5-氟尿嘧啶、顺铂对喉癌细胞株凋亡的影响及在荷瘤鼠动物模型中的作用观察[J]. 吴志圣,赵明,金春顺,陈鸥. 中国实验诊断学. 2013(02)
[9]piggyBac转座子应用研究进展[J]. 杨欢欢,魏峰,刘全. 动物医学进展. 2010(12)
[10]脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Mller细胞的比较[J]. 曾琦,夏晓波. 国际眼科杂志. 2010(02)
本文编号：3209790
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＮＡＭＡＬＷＡ小鼠（ＳＣＩＤ）移植瘤模型处理流程??
ＣＡＲ－Ｔ细胞体内杀瘤活性验证处理流程图??腹腔注射两次?邏制生??＾??１??＼＼???）?？?？?????????？??夭?〇?３?１０?１７?２４?３１?３２??＞ａｍ?ａｈｖａ细跑尾靜财注射??图１－１?ＮＡＭＡＬＷＡ小鼠（ＳＣＩＤ）移植瘤模型处理流程??ＣＡＲ－Ｔ细胞体内杀瘤活性验证处理流程图??＝次?小鼠挪麵麵識■ＩＪＳＩ??ｉ?ｌ－＾Ｈ??＼＊?＾??／?？?？?？?ｍ?？?？??＾?０?３?１０?１７?２４?３２??Ｒ＞湖腿静赃射??图１－２?Ｒａｊｉ细胞小鼠（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）移植瘤模型处理流程??２．４实验方法??２．４．１常规试剂的配方??１６４０完全培养基（１０％血清）：ＲＰＭＩ－１６４０培养液，置于４°Ｃ保存，临用前溶化??后加入１０％胎牛血清、１００Ｕ／ｍｌ青霉素和链霉素和０．２５ｎｇ／ｍｌ可溶性两性霉素Ｂ。??１６４〇完全培养基（２０％血清）：ＲＰＭＩ－１６４０培养液，置于４°Ｃ保存，临用前溶化??后入２０％胎牛血清，］００Ｕ／ｍｌ青霉素和链霉素，０．２５略／ｍｌ可溶性两性霉素Ｂ。??ＰＢＳ?缓冲液：８ｇＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、１．４４ｇＮａ２ＨＰ〇４?和?０．２４ｇＫＨ２Ｐ〇４，溶于?８００ｍｌ??蒸馏水中，用盐酸调节溶液的ｐＨ值至７．４，最后加蒸馏水定容至１Ｌ。在１３４°??Ｃ（１．０３４Ｘ?ｌ〇５Ｐａ）高压下蒸气灭菌２０分钟，保存存于室温或４°Ｃ冰箱中。??流式细胞术细胞清洗液：ｌｇＢＳＡ溶于ｌＯＯｍｌＰＢＳ，用０．４５?ｕｍ滤网过滤除菌后放??置４°Ｃ冰箱中保存。??１４??
二、结果??３．１?ＮＡＭＡＬＷＡ细胞模型小鼠体内肿瘤细胞分布情况??为了检测ＳＣＩＤ小鼠体内肿瘤细胞的分布及数量情况，在小鼠麻醉后向其腹??腔内注射Ｂｅｅｔｌｅ?Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ?Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ?Ｓａｌｔ甲虫焚光素钾盐。向小鼠体内注射的??ＮＡＭＡＬＷＡ细胞内含有人工转入的荧光素酶报告基因能够产生荧光素酶蛋白，??当其与小分子底物焚光素Ｂｅｅｔｌｅ?Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ?Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ?Ｓａｌｔ甲虫焚光素钾盐结合时??在氧、Ｍｇ２＋离子存在的条件下消耗ＡＴＰ发生氧化反应，将部分化学能转变为可??见光释放，从而被ＩＶ丨Ｓ?Ｓｐｅｃｔｒｕｍ?Ｓｙｓｔｅｍ小动物活体成像系统记录，通过比较不??同时间内小鼠体内肿瘤细胞发光情况的动态变化，从而分析推测出小鼠体内肿瘤??细胞的分布情况。通过小鼠活体荧光成像的结果可以发现注射进小鼠体内的??ＮＡＭＡＬＷＡ细胞能够稳定生存并不断进行增殖和扩散，见图１－３，１－４。该模型肿??瘤移植成功率达到１００％。并且在整个实验过程中未发生肿瘤自行消退现象。??…。關叫??ｌｌｌｌ；??ｄ?３麵醜Ｌ??图１－３活体荧光成像监测体内肿瘤细胞分布情况??２０??
【参考文献】：
期刊论文
[1]实体肿瘤免疫治疗的关键问题与对策[J]. 刘宝瑞. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2017(06)
[2]CAR-T细胞治疗实体瘤的挑战与思考[J]. 刘洋,朱宏丽,韩为东. 中国肿瘤临床. 2017(09)
[3]嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在常见儿童肿瘤治疗领域中的应用[J]. 史沛杰,方建培. 中国小儿血液与肿瘤杂志. 2017(01)
[4]消化系统恶性肿瘤血管正常化的研究进展[J]. 李隆敏,许桐瑛,朱文婷,谢蕊,周庆鑫,白玉贤. 中国肿瘤. 2016(12)
[5]CAR-T治疗恶性肿瘤的研究进展及趋势分析[J]. 刘永军,于雪蕾,张军华. 免疫学杂志. 2016(11)
[6]脂质体法与电穿孔法转染两种细胞效率的比较[J]. 张禾璇,单可人,何燕,张婷,王婵娟,官志忠. 重庆医学. 2014(33)
[7]淋巴瘤实验动物模型构建的研究与应用[J]. 熊豫麟,张远旭,黄云超,杨世华. 广东医学. 2014(09)
[8]苯乙酸联合5-氟尿嘧啶、顺铂对喉癌细胞株凋亡的影响及在荷瘤鼠动物模型中的作用观察[J]. 吴志圣,赵明,金春顺,陈鸥. 中国实验诊断学. 2013(02)
[9]piggyBac转座子应用研究进展[J]. 杨欢欢,魏峰,刘全. 动物医学进展. 2010(12)
[10]脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Mller细胞的比较[J]. 曾琦,夏晓波. 国际眼科杂志. 2010(02)
本文编号：3209790
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