缺失外显子2的新型RON变异体生物学特性的研究

发布时间：2021-09-24 02:24

　　实验背景:已知酪氨酸激酶受体RON的异常表达可以通过改变多种细胞功能导致恶性肿瘤的进展和转移。其中在基因水平上发生剪接变异是其蛋白表达异常的机制之一。本次实验我们在结肠癌细胞系HT29细胞中发现了一种新的RON剪接变异体:RONA165E2。该变异体在基因水平上缺乏编码外显子2的mRNA,其对应β链上的63个氨基酸缺失,从而产生了一个大小为165kda的单链蛋白。进一步实验发现蛋白RON△165E2表达于细胞内,与巨噬细胞刺激蛋白MSP无相互作用,并且该变异体无内在酪氨酸激酶活性。实验目的与方法:通过构建野生型及新型变异体RON质粒载体并转染人胚肾上皮细胞建立蛋白表达体系;通过免疫沉淀、免疫印迹、细胞功能实验、动物实验等了解变异体RON△165E2蛋白的生物学特性,并为下一步研究结直肠癌靶向治疗失败患者耐药机制提供重要的工具。实验结果:在表达变异体RON的人胚肾上皮细胞中,我们发现与表达野生型蛋白的上皮细胞相比,细胞内PI3K/Akt/mTOR通路存在过度激活,同时PTEN的磷酸化水平也明显升高。另外,在多种体内体外实验中我们发现RON△165E2促进了上皮细胞的迁移、肿瘤的生长。最后... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

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缩略词表
引言
1 材料与仪器
    1.1 细胞株及质粒
    1.2 临床标本
    1.3 抗体及引物
    1.4 试剂及材料
    1.5 仪器及设备
2 实验方法
    2.1 细胞培养
    2.2 质粒构建
    2.3 细胞转染
    2.4 细胞和组织蛋白提取
    2.5 细胞和组织蛋白定量
    2.6 免疫共沉淀和免疫印迹
        2.6.1 蛋白裂解物的预清除步骤
        2.6.2 蛋白裂解物的免疫沉淀步骤
        2.6.3 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
    2.7 RT-PCR和PCR
    2.8 细胞划痕修复
    2.9 细胞Transwell
    2.10 细胞表面蛋白标记
    2.11 细胞免疫荧光
    2.12 动物实验
    2.13 统计学方法
    2.14 溶液配置
3 实验结果
    3.1 在人类结直肠癌细胞系中发现新的RON剪接变异体
    3.2 在HEK293上皮细胞中稳定转染表达新变异体蛋白RON△165~(E2)
    3.3 变异体RON△165~(E2)蛋白表达于细胞内
    3.4 PI3K/Akt/mTOR通路在HEK293 RON△165~(E2)细胞中持续激活
    3.5 RON△165~(E2)促进PTEN蛋白磷酸化
    3.6 RON△165~(E2)促进HEK293细胞移动
    3.7 RON△165~(E2)蛋白促进小鼠皮下肿瘤的生长
    3.8 RON△165~(E2)变异体与肿瘤临床分期相关
4 讨论
参考文献
综述
    参考文献
作者简历及在读期间所取得的科研成果



本文编号：3406905