miR-200c基因甲基化检测方法的建立及其在乳腺癌标本中的应用

发布时间：2017-05-04 12:10

  本文关键词：miR-200c基因甲基化检测方法的建立及其在乳腺癌标本中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：微小RNA(microRNA,miRNA)是一类单链非编码小分子RNA,其通过与靶m RNA的3’端非翻译区结合,引起靶m RNA降解或者翻译抑制,产生转录后基因沉默,从而调控基因的表达。已有大量研究表明,miRNA基因的表达和蛋白编码基因一样受到表观遗传调控,其表达下调可能与miRNA启动子区CpG岛的甲基化有关。miR-200c是与乳腺癌转移密切相关的miRNA,尽管miR-200c基因的甲基化与多种肿瘤的发生、发展有关,但限于miR-200c基因关键性CpG位点的确认尚存争议,以及检测方法的局限性,使得miR-200c基因的甲基化检测在组织标本中的应用尚未得到普遍的开展。目的:确认miR-200c基因甲基化的的关键性CpG位点;建立miR-200c基因甲基化检测的定性与定量MSP分析方法,并应用于乳腺癌组织标本的分析。方法:采用原位miRNA杂交技术检测miR-200c在乳腺病变组织中的表达;去甲基化药物5-Aza-Cd R对四种乳腺癌细胞株进行处理,qRT-PCR方法检测乳腺癌细胞中miR-200c的表达水平;运用在线软件预测miR-200c基因启动子区的CpG岛;亚硫酸氢钠修饰后克隆测序对5-Aza-Cd R处理的乳腺癌细胞株miR-200c基因CpG岛11个CpG位点进行检测;建立MSP与d HPLC方法检测乳腺癌细胞株miR-200c基因CpG岛甲基化水平;应用MSP定性与定量方法对乳腺癌癌灶组织和癌旁组织检测miR-200c基因CpG岛甲基化。结果:1、原位杂交结果显示,乳腺癌组织中miR-200c表达与正常和良性乳腺病变组织相比,并无统计学差异;2、qRT-PCR结果显示;与0μmol/L对照组相比,5μmol/L的5-Aza-Cd R处理组中BT549与MDA-MB-231细胞株的miR-200c水平明显增高(p0.05),而MCF7与T47D细胞的miR-200c水平变化不大;3、网站预测结果显示,在miR-200c编码基因起始位点前316~170bp位置处有一长度为147bp的CpG岛,包含11个CpG位点;4、亚硫酸氢钠克隆测序结果显示,0μmol/L的5-Aza-Cd R对照组中,miR-200c表达高的MCF7和T47D细胞株miR-200c基因11个CpG位点甲基化频率与甲基化总频率明显低于miR-200c表达低的BT549和MDA-MB-231细胞株;5、建立的MSP与d HPLC方法验证了miR-200c基因CpG岛在MDA-MB-231细胞株中高甲基化与MCF7细胞株中低甲基化;6、乳腺癌组织定性和定量MSP结果分析提示,miR-200c基因的甲基化频率在癌灶组与癌旁组中未见统计学差异。结论:1、miR-200c编码基因起始位点前316~170bp位置处有一长度为147bp的CpG岛,此区域为关键性甲基化区域,该区域的CpG位点甲基化状态与miR-200c的表达有着紧密关联;2、建立的定性MSP与d HPLC方法能特异性区分乳腺癌细胞株miR-200c基因CpG岛甲基化状态,为后续乳腺癌组织标本的检测提供了便利。
【关键词】：miR-200c 甲基化 CpG岛 乳腺癌
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英缩略词表10-12
• 第1章 引言12-14
• 第2章 实验材料、仪器与试剂14-18
• 2.1 细胞、临床标本和组织芯片14-15
• 2.2 主要仪器15-16
• 2.3 主要试剂16-18
• 第3章 实验方法18-34
• 3.1 主要试剂的配制18-21
• 3.1.1 常规分子生物学试剂的配制18
• 3.1.2 原位杂交主要试剂的配制18
• 3.1.3 细胞培养主要试剂的配制18-19
• 3.1.4 真核细胞DNA提取所需试剂的配制19
• 3.1.5 PCR所需试剂和溶液的配制19-20
• 3.1.6 盐析法提取组织DNA所需试剂的配制20
• 3.1.7 亚硫酸氢钠法甲基化修饰DNA所需试剂的配制20-21
• 3.1.8 LB培养基的配制21
• 3.2 乳腺癌组织MIR-200C原位杂交21-22
• 3.3 细胞培养22-24
• 3.3.1 细胞复苏22
• 3.3.2 细胞传代22-23
• 3.3.3 细胞冻存23
• 3.3.4 细胞计数23
• 3.3.5 5-AZA-Cd R用药实验23-24
• 3.4 CPG岛预测24
• 3.5 RNA提取、MIRNA逆转录与实时荧光定量-PCR24-26
• 3.5.1 总RNA的提取（Trizol法）24-25
• 3.5.2 miRNA逆转录25
• 3.5.3 Real-time PCR25-26
• 3.6 真核细胞DNA的提取26
• 3.7 亚硫酸氢钠甲基化修饰DNA26-27
• 3.8 TA克隆测序27-30
• 3.8.1 通用引物PCR、PCR产物的纯化27-28
• 3.8.2 TA克隆28
• 3.8.3 PCR法鉴定阳性克隆28-29
• 3.8.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳29
• 3.8.5 产物测序29
• 3.8.6 测序结果分析的相关软件29-30
• 3.9 盐析法从石蜡包埋组织中提取DNA30-31
• 3.10 定性MSP31
• 3.11 定量MSP31-32
• 3.12 建立DHPLC法检测乳腺癌细胞与组织中的MIR-200C32
• 3.13 统计32-34
• 第4章 实验结果34-42
• 4.1 乳腺组织芯片MIR-200C原位杂交34-35
• 4.2 5-AZA-CDR对四株乳腺癌细胞MIR-200C表达的影响35
• 4.3 MIR-200C编码基因启动子CPG岛预测35-36
• 4.4 BCS方法检测细胞MIR-200C编码基因启动子CPG岛甲基化水平36-39
• 4.4.1 miR-200c编码基因启动子CpG岛序列BSP引物设计36
• 4.4.2 miR-200c启动子CpG岛的BSP引物PCR扩增36-37
• 4.4.3 miR-200c编码基因CpG岛BSP引物扩增后TA克隆37
• 4.4.4 miR-200c编码基因启动子区BSP引物扩增后TA克隆测序分析37-39
• 4.5 定性MSP法验证乳腺癌细胞MIR-200C基因启动子区CPG岛甲基化状态39
• 4.6 DHPLC验证乳腺癌细胞中MIR-200C启动子区CPG岛甲基化状态39-40
• 4.7 乳腺组织标本MSP定性分析40
• 4.8 乳腺组织标本MSP定量分析40-42
• 第5章 讨论42-46
• 第6章 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-51
• 综述51-62
• 参考文献60-62

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