基于减毒单核细胞增多性李斯特菌为载体的肿瘤免疫技术探究
发布时间：2021-10-22 06:46
单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）,简称单增李斯特菌,是一种革兰氏阳性胞内病原菌,可在多种细胞中增殖。李斯特菌感染宿主细胞后可以通过两种不同的主要组织相容性复合体（MHC I和MHC II）途径激活机体适应性细胞免疫反应。由于李斯特菌独特的细胞内感染机制,因此通过基因改造获得减毒李斯特菌作为一种新型的抗原递送活载体已广泛用于肿瘤的免疫治疗研究。我们团队前期研究发现,突变李斯特菌重要毒力因子溶血素LLO（由hly基因编码）上2个关键氨基酸位点后细菌毒力大大降低,但仍保留了部分在细胞内增殖能力,因此本研究主要基于LLO关键活性位点改造获得减毒李斯特菌抗原递送载体,并用于小鼠宫颈癌模型的免疫治疗效果评价。本研究以单增李斯特菌参考菌株EGD-e为背景菌株,利用氨基酸突变和同源重组技术直接在李斯特菌hly基因上进行遗传操作,获得了减毒李斯特菌（LADS）,并通过分子生物学、细胞生物学和感染生物学等手段对该毒株的生物特性和安全性开展评价。研究发现:LADS能正常在BHI培养基中生长,能够稳定合成和分泌LLO突变蛋白,但其分泌的LLO由于关键活性位点突变而丧...
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
李斯特菌感染模式图
文献综述5李斯特菌还可以诱导肿瘤组织中的调节性T细胞（Treg）减少[32,33]，Treg细胞具有维持机体免疫耐受的作用，因此降低Treg水平有利于CTL细胞的杀细胞作用。由于李斯特菌具有独特的胞内寄生生活，不仅能递呈自身抗原，引起机体的强烈的适应性免疫反应，并且能够递呈外源抗原，增强特异性免疫反应，这些特征使减毒李斯特菌成为有前途的候选癌症疫苗载体。4活细菌疫苗载体研究现状一个多世纪以来，灭活或减毒细菌被用于治疗癌症取得了巨大的成功，从19世纪的Coley疫苗[33]开始，到被批准的膀胱癌疫苗[34]。基于细菌的疫苗作为抗原传递载体具有一些优势，包括生产成本低，遗传稳定性，安全性和有效的抗肿瘤作用[35]。目前，几种沙门氏菌，志贺氏菌，乳球菌，李斯特菌和分枝杆菌属细菌已被用作抗癌或抗感染的疫苗载体[36,37]。迄今为止，两种沙门氏菌血清型已被广泛用于抗原传递的活载体，成为设计和开发人类疾病的新疫苗。沙门氏菌递送的蛋白质可以通过MHCII类分子呈递，通常引起Th2型免疫应答[38]。这缺少了有效的CD8+T细胞介导的特异性细胞免疫。为了克服这一障碍，已经建立了几种策略：通过基因改造使沙门氏菌可以携图2李斯特菌感染引起的机体免疫机制Figure2HostimmunemechanismsinresponsetoL.monocytogenesinfection
试验研究202试验结果2.1LADS体外生长能力不受影响通过同源重组的方法构建李斯特减毒株，经过抗性筛选后，将已不含抗性质粒的菌株，提取基因组扩增对应片段，送测序，测序结果显示关键位点已经突变为丙氨酸的菌株即为成功构建的减毒株，将其命名为LADS，并对其进行体外生长能力检测。如图1.1所示，LADS在BHI中的生长能力和野生株的生长能力无显著差异。因此，在李斯特菌hly基因上直接突变关键位点不会对李斯特菌体外生长造成影响。2.2LADS不影响LLO突变蛋白合成分泌由于LLO可以诱导细胞产生不同的细胞因子，这些因子对于在感染宿主中产生获得性免疫至关重要。因此，通过Westernblot来验证LLO突变蛋白是否能正常合成分泌。如图1.2所示，LADS能正常合成分泌LLO突变蛋白，说明hlyC端2个关键位点的突变不会对LLO蛋白合成分泌造成影响。图1.1EGD-e，Δhly和LADS的体外生长曲线Figure1.1InvitrobacterialgrowthofEGD-e,ΔhlyandLADSstrains图1.2Westernblot验证LLO蛋白表达Figure1.2CytoplasmicandsecretedLLOdetectedbyWesternblot
本文编号：3450581
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
李斯特菌感染模式图
文献综述5李斯特菌还可以诱导肿瘤组织中的调节性T细胞（Treg）减少[32,33]，Treg细胞具有维持机体免疫耐受的作用，因此降低Treg水平有利于CTL细胞的杀细胞作用。由于李斯特菌具有独特的胞内寄生生活，不仅能递呈自身抗原，引起机体的强烈的适应性免疫反应，并且能够递呈外源抗原，增强特异性免疫反应，这些特征使减毒李斯特菌成为有前途的候选癌症疫苗载体。4活细菌疫苗载体研究现状一个多世纪以来，灭活或减毒细菌被用于治疗癌症取得了巨大的成功，从19世纪的Coley疫苗[33]开始，到被批准的膀胱癌疫苗[34]。基于细菌的疫苗作为抗原传递载体具有一些优势，包括生产成本低，遗传稳定性，安全性和有效的抗肿瘤作用[35]。目前，几种沙门氏菌，志贺氏菌，乳球菌，李斯特菌和分枝杆菌属细菌已被用作抗癌或抗感染的疫苗载体[36,37]。迄今为止，两种沙门氏菌血清型已被广泛用于抗原传递的活载体，成为设计和开发人类疾病的新疫苗。沙门氏菌递送的蛋白质可以通过MHCII类分子呈递，通常引起Th2型免疫应答[38]。这缺少了有效的CD8+T细胞介导的特异性细胞免疫。为了克服这一障碍，已经建立了几种策略：通过基因改造使沙门氏菌可以携图2李斯特菌感染引起的机体免疫机制Figure2HostimmunemechanismsinresponsetoL.monocytogenesinfection
试验研究202试验结果2.1LADS体外生长能力不受影响通过同源重组的方法构建李斯特减毒株，经过抗性筛选后，将已不含抗性质粒的菌株，提取基因组扩增对应片段，送测序，测序结果显示关键位点已经突变为丙氨酸的菌株即为成功构建的减毒株，将其命名为LADS，并对其进行体外生长能力检测。如图1.1所示，LADS在BHI中的生长能力和野生株的生长能力无显著差异。因此，在李斯特菌hly基因上直接突变关键位点不会对李斯特菌体外生长造成影响。2.2LADS不影响LLO突变蛋白合成分泌由于LLO可以诱导细胞产生不同的细胞因子，这些因子对于在感染宿主中产生获得性免疫至关重要。因此，通过Westernblot来验证LLO突变蛋白是否能正常合成分泌。如图1.2所示，LADS能正常合成分泌LLO突变蛋白，说明hlyC端2个关键位点的突变不会对LLO蛋白合成分泌造成影响。图1.1EGD-e，Δhly和LADS的体外生长曲线Figure1.1InvitrobacterialgrowthofEGD-e,ΔhlyandLADSstrains图1.2Westernblot验证LLO蛋白表达Figure1.2CytoplasmicandsecretedLLOdetectedbyWesternblot
本文编号：3450581
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