染色体驱动蛋白KIF4A通过与细胞膜蛋白supervillin的相互作用影响胃癌细胞的迁移侵袭

发布时间：2017-05-04 17:09

  本文关键词：染色体驱动蛋白KIF4A通过与细胞膜蛋白supervillin的相互作用影响胃癌细胞的迁移侵袭，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胃癌是全国范围内致死率最高的恶性疾病之一,胃癌转移是导致其高致死率的主要因素。目前对于胃癌发病机制及其治疗方面已有广泛研究,但是对于胃癌依旧没有很好的治疗方法,胃癌仍然是威胁人类生命健康的重大疾病之一。为了探讨临床胃癌转移的分子机制,寻找潜在的有效治疗胃癌的分子靶点,我们在前期工作基础上,深入研究了驱动蛋白分子KIF4A对胃癌细胞迁移侵袭的调控。研究表明,驱动蛋白分子KIF4A是保证细胞正常分裂的一个关键蛋白,KIF4A的表达异常会导致肿瘤的发生和发展。然而KIF4A参与调控肿瘤转移过程鲜见报道,我们深入研究了KIF4A蛋白分子对胃癌细胞的迁移侵袭的调控作用,进而阐明KIF4A在调控肿瘤转移过程中的分子作用机制。Supervillin (SVIL)是一种与F-actin结合的膜蛋白,为外周膜蛋白,普遍表达于人体各组织,有研究表明,SVIL在肿瘤细胞的侵袭过程中起到一定的作用,并且通过酵母双杂交实验证明了其在细胞内能与KIF4A相结合,因此猜想是否KIF4A调控肿瘤细胞转移过程的分子机制与SVIL有关,并对这一假设做了相关的实验验证。本研究工作从以下几个方面进行展开：1.我们利用脂质体2000分别转染pGPU6-GFP-KIF4A 和 pGPU6-GFP-NC质粒以及pEGFP-C1、pEGFP-KIF4A 和 pEGFP-SVIL的质粒于SGC-7901细胞中,利用G418进行筛选,构建出了KIF4A低表达SGC稳筛细胞株、KIF4A局表达SGC稳筛细胞株、SVIL高表达SGC稳筛细胞株以及两个对照细胞株,并通过Western Blot和免疫荧光染色鉴定这几个稳筛的细胞株。2.运用KIF4A低表达胃癌细胞株和KIF4A高表达胃癌细胞株分别进行划痕实验和Transwell实验,观察KIF4A对胃癌细胞SGC-7901迁移的影响。3.对KIF4A低表达胃癌细胞株和KIF4A高表达胃癌细胞株进行 vinculin染色并进行计数,应用Origin8.0软件作图,观察KIF4A对胃癌细胞SGC-7901侵袭的影响。4.分别利用IP技术和免疫荧光染色技术证明KIF4A 与 supervillin在分子和细胞水平上的结合,为进一步研究KIF4A 与 SVIL之间的相互作用奠定了基础。5.分析研究supervillin分子的功能结构域,利用分子克隆技术构建Flag-SVIL的截短突变体,进而可以研究KIF4A与supervillin的哪个功能域结合。
【关键词】：胃癌 驱动蛋白 KIF4A 迁移 侵袭 SVIL 黏着斑 vinculin
【学位授予单位】：天津师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-24
• 1.1 驱动蛋白(Kinesin)的概述9-10
• 1.2 染色体驱动蛋白KIF4A的概述10-11
• 1.3 染色体驱动蛋白KIF4A的主要功能11-14
• 1.3.1 KIF4A在正常细胞有丝分裂中的作用11
• 1.3.2 KIF4A调控细胞骨架微管的动态不稳定性11-13
• 1.3.3 KIF4A在肿瘤形成中的作用13-14
• 1.4 Supervillin(SVIL)的发现与结构14-15
• 1.5 SVIL在肿瘤细胞侵袭过程中的作用15-19
• 1.5.1 黏着斑与SVIL15-17
• 1.5.2 细胞伪足与SVIL17-19
• 1.6 肿瘤转移概述19
• 1.7 肿瘤转移的过程19-20
• 1.8 肿瘤转移的影响因素20-21
• 1.8.1 细胞黏附因子20
• 1.8.2 血管形成20-21
• 1.8.3 蛋白降解酶21
• 1.9 胃癌及胃癌转移21
• 1.10 细胞迁移概述21-22
• 1.11 细胞迁移的过程22-24
• 1.11.1 局部细胞膜前伸形成伪足22
• 1.11.2 细胞伪足粘附到基底面22-23
• 1.11.3 细胞骨架的收缩23
• 1.11.4 细胞尾部脱粘附及回缩23-24
• 1.12 细胞侵袭24
• 第二章 材料与方法24-40
• 2.1 实验材料24-28
• 2.1.1 实验材料与细胞株24
• 2.1.2 主要试剂与仪器24-28
• 2.2 实验方法28-40
• 2.2.1 细胞培养28
• 2.2.2 细胞冻存和复苏28-29
• 2.2.3 细胞转染实验29-30
• 2.2.4 SGC-790I细胞株内KIF4A蛋白表达水平检测30-32
• 2.2.5 稳筛细胞株的构建32-33
• 2.2.6 免疫荧光染色33-34
• 2.2.7 细胞迁移实验34-35
• 2.2.8 免疫共沉淀(IP)实验35-36
• 2.2.9 质粒构建实验36-40
• 第三章 结果与分析40-59
• 3.1 KIF4A影响胃癌细胞迁移40-48
• 3.1.1 KIF4A低表达与过表达的SGC稳筛细胞株的构建与验证40-43
• 3.1.2 低表达KIF4A增强SGC细胞的迁移运动能力43-46
• 3.1.3 过表达KIF4A降低SGC细胞的迁移运动能力46-48
• 3.2 KIF4A影响胃癌细胞(SGC)的侵袭48-50
• 3.3 KIF4A与SVIL的关系研究50-59
• 3.3.1 SVIL过表达细胞株(SGC-SVIL)稳筛细胞株的构建与验证50-53
• 3.3.2 SGC-SVIL稳筛细胞株的外源GFP-SVIL与内源KIF4A结合53
• 3.3.3 KIF4A与SVIL在细胞内共定位53-55
• 3.3.3.1 内源KIF4A与外源的SVIL在胃癌细胞(SGC)中共定位53-55
• 3.3.3.2 内源SVIL与外源GFP-KIF4A在胃癌细胞(SGC)中共定位55
• 3.3.4 Flag-SVIL截短突变体的构建55-59
• 3.3.4.1 PCR引物设计55-56
• 3.3.4.2 目的片段及载体的制备56-58
• 3.3.4.3 目的片段与载体连接58-59
• 3.3.4.4 连接后的质粒测序59
• 第四章 讨论59-63
• 4.1 稳筛细胞株构建及鉴定中的问题探讨59-61
• 4.1.1 稳筛细胞株构建中的问题59-61
• 4.1.2 稳筛细胞株鉴定中问题的探讨61
• 4.2 质粒构建过程中问题的探讨61-62
• 4.3 本课题进一步的实验思路探讨62-63
• 第五章 结论63-64
• 参考文献64-70
• 致谢70

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