TRIM67对胃癌细胞增殖及凋亡影响机制的研究

发布时间：2017-05-06 12:04

  本文关键词：TRIM67对胃癌细胞增殖及凋亡影响机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:三结构域蛋白67(TRIM67)是三结构域蛋白家族的其一个成员,它在胃癌中处于沉默或下调的状态,目前在胃癌中未见相关文献,其作用机制尚不明确。我们通过实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)及流式细胞术等相关实验技术验证TRIM67与胃癌细胞的生长、凋亡等之间的关系。主要阐明该基因在胃癌中作为一个肿瘤抑制基因的生物学功能。方法:1选取21对香港中文大学威尔斯亲王医院的胃癌组织和癌旁正常组织样本为实验对象,运用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)测定TRIM67基因在这21对样本中的表达水平,并分析胃癌组织和癌旁正常组织中TRIM67的表达水平差异。2运用相关实验技术,(1)反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)验证TRIM67在胃癌细胞株(AGS、BGC823、MGC803、MKN1、MKN45、MKN74、SNU1、SNU638)中的表达水平;(2)运用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS)对相关胃癌细胞株中TRIM67启动子序列进行检测;(3)应用2u M浓度的5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza)对胃癌细胞株(AGS、BGC823、MKN45、SNU1、SNU638)去甲基化处理96小时后,通过RT-PCR检测细胞株中的TRIM67的表达水平,并以未用5-Aza处理的对照组进行对比。3构建pc DNA3.1-2×Flag-TRIM67重组质粒并转染胃癌细胞株AGS和MKN1,以pc DNA3.1-vector为对照组,G418筛选出AGS和MKN1稳定细胞株后,分别以m RNA和蛋白质水平检测该胃癌细胞株过表达TRIM67后的表达。运用MTT实验进一步表明TRIM67对胃癌细胞株细胞生长活力的影响,并通过软琼脂克隆形成实验验证该基因对胃癌细胞生长及集落形成能力的作用情况。以TRIM67表达较高的胃癌细胞株MKN74为基础,应用sh RNA(short hairpin RNA)敲低TRIM67并获得稳定细胞株。在m RNA水平检测转染该基因的表达情况,并运用MTT实验和软琼脂克隆形成实验检测敲低TRIM67后对胃癌细胞增殖及集落形成的能力。4以胃癌细胞株AGS和MKN1转染pc DNA3.1-2×Flag-TRIM67的稳定细胞株和pc DNA3.1-vector对照组的稳定细胞株为基础,用碘化丙啶(PI)对胃癌细胞株进行染色以流式细胞术检测实验组和对照组的细胞周期变化,运用Flowjo软件分析TRIM67基因的与胃癌细胞细胞周期的关系和作用。应用蛋白质印迹法对细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4、P21和P27进行检测,以明确TRIM67对细胞周期相关蛋白的作用影响。5应用Annexin V和7-AAD(7-amino-actinomycin)双染过表达TRIM67的胃癌细胞株AGS和MKN1,通过流式细胞术检验实验组和对照组细胞凋亡的情况,对TRIM67基因影响胃癌细胞的凋亡进一步分析。并运用蛋白质印迹法对细胞凋亡的相关蛋白如活化形式的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly ADP ribose polymerase,PARP)进行检测,验证TRIM67对胃癌细胞凋亡的作用机制。结果:1胃癌组织及癌旁正常组织中TRIM67的表达变化选取21对胃癌组织及癌旁正常组织对TRIM67基因的m RNA水平的检测发现,实验表明胃癌组织中TRIM67的表达较癌旁正常组织中该基因的表达水平下调(P0.01,n=21)。2 TRIM67在胃癌细胞株中表达情况及其启动子甲基化水平的关系我们首先在胃癌细胞株中对TRIM67基因m RNA水平的表达进行检测,发现TRIM67在8个胃癌细胞株中7个细胞株(AGS、BGC823、MGC803、MKN45、MKN1、SNU1、SNU638)的表达沉默或明显下调,胃癌细胞株MKN74及人胃粘膜上皮细胞株(GES1)有一定表达水平,在正常胃粘膜上皮组织中表达正常。进而我们用亚硫酸氢盐测序法测定TRIM67启动子序列的Cp G甲基化位点及甲基化程度。我们发现7条胃癌细胞株的TRIM67启动子序列甲基化程度较高,而MKN74和GES1该基因的启动子序列甲基化程度较低,而在胃正常上皮粘膜组织中未发现甲基化。我们应用5-Aza对胃癌细胞株(AGS、BGC823、MKN45、SNU1、SNU638)进行去甲基化处理,处理后发现TRIM67在这5条胃癌细胞株中重新表达或表达上调。3过表达或下调TRIM67对胃癌细胞生长的影响TRIM67在胃癌细胞株和组织的沉默说明该基因有可能是抑癌基因,我们通过TRIM67在胃癌细胞株中的表达情况,选取胃癌细胞株AGS和MKN1。以RT-PCR和Western blot analysis以验证TRIM67在AGS和MKN1的转染效率。过表达TRIM67后,MTT实验显示改基因明显抑制AGS(P0.0001)和MKN1(P0.0001)胃癌细胞株的细胞生长活力;同时软琼脂克隆形成实验验证了TRIM67能够显著的抑制AGS(P0.01)和MKN1(P0.01)的细胞生长能力及集落形成能力。为进一步证明TRIM67对胃癌的抑制作用,因此我们运用RNAi技术在TRIM67表达较高的胃癌细胞株MKN74中敲除该基因,以稳定细胞株进行实验,MTT实验和软琼脂克隆形成实验证明敲除TRIM67后可促进MKN74细胞的增殖能力(P0.01)及集落形成能力(P0.01)。4胃癌细胞株中TRIM67对细胞周期的作用为确定TRIM67抑制胃癌细胞的生长的机制,我们应用流式细胞术分析了TRIM67基因对细胞周期的影响。实验表明在胃癌细胞株中过表达TRIM67能够明显增加G1期的细胞数,相反在S期的细胞数是下降的。同时对流式细胞术的结果进行进一步的研究,我们应用Western blot analysis验证了过表达TRIM67后对相关细胞周期蛋白的影响,结果显示该基因能够抑制Cyclin D1和CDK4的表达,并且促进了P21和P27的表达,以阻止细胞周期的进行。5 TRIM67对胃癌细胞凋亡的影响为验证TRIM67与胃癌细胞凋亡的关系,我们用流式细胞术对过表达TRIM67后的胃癌细胞株(Annexin V和7-AAD双染)进行凋亡检测。结果发现在AGS和MKN1胃癌细胞株中,AGS细胞株中过表达组的总凋亡数要大于空白对照组(P0.05),在MKN1细胞株中过表达组的早期凋亡数(P0.001)、晚期凋亡数(P0.05)大于对照组。同时AGS和MKN1细胞株转染TRIM67后,促进了细胞凋亡的相关蛋白如活化形式的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和PARP的表达以介导细胞凋亡。结论:1在胃癌组织中TRIM67m RNA表达水平要明显低于癌旁正常组织。2 TRIM67基因的启动子序列高度甲基化是导致该基因在胃癌细胞株中表达沉默或下调的重要因素。3 TRIM67基因可能作为一个抑癌基因可以抑制胃癌细胞的增殖和集落形成能力。4研究显示TRIM67通过抑制cyclin-D1和CDK4并上调P21和P27影响G1/S期阻止细胞周期的进行。5同时TRIM67基因通过激活活化形式的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9及PARP诱导了胃癌细胞的凋亡。
【关键词】：三结构域蛋白67 甲基化 胃癌 细胞周期 凋亡
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文缩写12-13
• 前言13-15
• 材料与方法15-23
• 结果23-25
• 附图25-31
• 讨论31-38
• 结论38-39
• 参考文献39-43
• 综述 TRIM蛋白家族的结构功能及其与肿瘤的关系43-54
• 参考文献49-54
• 致谢54-55
• 个人简历55

【参考文献】

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本文编号：348344