甘草次酸影响自噬及Bcl-2抗凋亡抑制胃癌SGC7901细胞增殖

发布时间：2017-05-06 13:17

  本文关键词：甘草次酸影响自噬及Bcl-2抗凋亡抑制胃癌SGC7901细胞增殖，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)又称甘草亭酸,属于齐墩果烷型五环三萜化合物,是甘草的主要的活性物质之一。GA对人肝癌、宫颈癌、乳腺癌、早幼粒细胞白血病等肿瘤具有良好的抗癌活性,且作用机制与细胞凋亡有关,伴有抑凋亡蛋白基因Bcl-2的下降。研究发现GA还可以通过诱导自噬的机制来抑制肿瘤细胞的增殖。GA抑制胃癌细胞增殖的研究尚少,有报道GA及其衍生物能够呈浓度和时间依赖性地抑制胃癌细胞BGC823和SGC7901的增殖,但抑制机制的研究较少。目的本文研究了GA在6.25~200μmol/L浓度范围内,作用胃癌SGC7901细胞的时间达48 h时,对细胞增殖、凋亡和自噬的影响,为GA抑制胃癌细胞增殖作用及其分子机制提供了理论依据。方法1.细胞培养:将胃癌SGC7901细胞接种在由浓度为10%的胎牛血清、100U/ml青霉素100U/ml链霉素双抗以及RPMI1640培养基配制的完全培养液中,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育培养。2.实验分组:设实验组1~7、阴性对照组和培养基调零组,实验组1~7为培养细胞加入含GA的二甲基亚砜(DMSO)溶液,使GA的终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、150、200μmol/L,阴性对照组加入和终浓度GA相同体积的DMSO。3.MTT法检测GA对胃癌SGC7901细胞增殖的影响:除实验组1~7、阴性对照组外,还设培养基调零组,培养基调零组为无细胞的培养基。取对数生长期的SGC7901细胞,药物作用48小时后,加入终浓度为0.5mg/ml的MTT溶液继续培养4h;轻轻倒扣出培养液,加入DMSO溶液,避光并振摇15~30 min;酶标仪上测定波长为492 nm的吸光度值(OD)。每次实验组1~7、阴性对照组和培养基调零组均设3个复孔,重复实验3次。计算GA对肿瘤细胞的抑制率和IC50。4.流式细胞仪检测GA对胃癌SGC7901细胞DNA和凋亡的影响:实验组1~7和阴性对照组药物作用SGC7901细胞48 h,碘化丙啶(PI)单染流式细胞仪检测细胞DNA的情况;用Annexin V-FITC和PI染色后,流式细胞仪下检测细胞凋亡的情况,以GA终浓度为IC50作用48 h的SGC7901细胞分别进行Annexin V-FITC和PI单染作为染色对照。5.Western Blot检测GA对胃癌SGC7901细胞的自噬相关蛋白Beclin1、Lc-3和抗凋亡蛋白Bcl-2的影响:提取实验组和阴性对照组细胞的总蛋白,蛋白定量后,取30μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电压200 V,时间60 min。电转移至NC膜,电流300 m A,时间90 min。用5%脱脂牛奶封闭2h。对照预染蛋白Marker,裁取Beclin1、Lc-3、Bcl-2、β-actin条带所处相关范围的NC膜;分别与1:1000兔抗Beclin1、兔抗Lc-3、鼠抗β-actin和1:500的兔抗Bcl-2抗体室温孵育2 h或4℃过夜;继之,与1:3000的羊抗鼠Ig G或羊抗兔Ig G室温摇育1 h;发光显影法在Amersham Imager 600仪器记录结果,用Image J软件来检测免疫印迹条带的平均灰度。6.统计学处理:使用SPSS19.0软件进行统计学的分析,数据以均数±标准差((?)±s)的形式表示,组间比较用方差分析,P0.05为差异有统计学意义。结果1.GA对胃癌SGC7901细胞增殖的影响:MTT法测定结果显示,不同浓度的GA作用胃癌SGC7901细胞48 h后,对其增殖抑制的作用在12.5~100μmol/L之间有统计学差异(P0.05),且呈浓度依赖性,100~200μmol/L之间的差异无统计学意义(P0.05),IC50为74.25μmol/L。2.GA对胃癌SGC7901细胞自噬的影响:Western Blot结果显示:与对照组相比,GA作用SGC7901细胞48 h后,自噬相关蛋白Beclin1的表达在6.25~50μmol/L浓度增加趋势明显,50μmol/L后逐渐减弱或消失;Lc-3的表达在6.25~100μmol/L浓度与对照组相似,100μmol/L后减弱或消失。3.GA对胃癌SGC7901细胞凋亡的影响:PI单染流式细胞仪结果显示,不同浓度的GA对胃癌SGC7901细胞的DNA影响有差异,细胞的亚二倍体数量在12.5~150μmol/L之间逐渐增加,有统计学差异(P0.05),且呈浓度依赖性。Annexin V-FITC和PI染色流式细胞仪结果显示,与对照组相比较,不同浓度的GA作用SGC7901细胞48 h后,细胞的早期凋亡、晚期凋亡和坏死数量不同,低于150μmol/L浓度作用细胞的早期凋亡率呈浓度依赖性增加,晚期凋亡和坏死率也呈增加趋势。4.GA对胃癌SGC7901的Bcl-2蛋白表达的影响:Western Blot检测结果显示,与对照组相比,GA作用SGC7901细胞48 h后,Bcl-2蛋白的表达在6.25~100μmol/L浓度与对照组相似,100μmol/L后逐渐减弱。半定量分析显示,Bcl-2蛋白的表达在浓度低于12.5μmol/L时有增加趋势;高于12.5μmol/L后有浓度依赖性的递减趋势。结论1.GA能够呈浓度依赖性地抑制胃癌SGC7901细胞的增殖,当GA浓度超过100μmol/L,抑制细胞增殖的效率下降。2.GA影响SGC7901细胞自噬有双向性,低于IC50浓度的GA主要加速SGC7901细胞的自噬体形成,高于IC50浓度的GA减少SGC7901细胞自噬体的形成和数量。3.GA能剂量依赖性的促进胃癌SGC7901细胞的早期凋亡、晚期凋亡和坏死,且抑制率达到90%以后,细胞凋亡继续增加;GA对SGC7901细胞Bcl-2的抗凋亡作用有双向性,浓度低于17%的IC50时增强,高于17%的IC50时呈浓度依赖性减弱。
【关键词】：甘草次酸 增殖抑制 凋亡 自噬 SGC7901
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-13
• 前言13-15
• 1 材料与方法15-24
• 2 结果24-31
• 3 讨论31-34
• 4 小结34-35
• 参考文献35-39
• 综述：甘草次酸的抗肿瘤作用及机制的研究进展39-55
• 参考文献46-55
• 攻读学位期间发表文章情况55-56
• 致谢56-57
• 个人简历57

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