长链非编码RNA HOTAIR对胃癌细胞恶性生物学行为影响的研究
发布时间：2021-11-17 09:55
目的:探讨长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）HOTAIR在胃癌中的表达及其通过竞争性结合miR-206对胃癌细胞的恶性生物学行为的影响及相关作用机制。方法:实时荧光定量PCR分别检测LncRNA HOTAIR及miR-206在胃癌组织与癌旁组织,胃癌细胞株（SGC-7901、AGS）与正常胃上皮细胞中（GES-1）的表达情况。通过构建稳定沉默HOTAIR表达（si-HOTAIR）及其阴性对照（si-NC）质粒和/或过表达miR-206及其对照组（miR-206 mimics/NC）质粒,分别对体外培养的人胃癌细胞株SGC-7901、AGS进行转染。下调HOTAIR表达和/或过表达miR-206后,通过CCK8实验、细胞克隆形成实验以及EDU实验来检测各组细胞的增殖能力;细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测各组细胞的迁移及侵袭能力;通过Annexin V-FITC流式细胞术来检测转染后各组细胞的凋亡率。利用生物信息学软件在线预测HOTAIR与miR-206的可能结合位点,然后通过双荧光素酶报告基因实验验证两者结合并相互作用。通过动物实验观察接...
【文章来源】：蚌埠医学院安徽省
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
LncRNAHOTAIR胃癌组织（A）及胃癌细胞（B）中的表达情况
2.2质粒转染及构建异常表达细胞株将小干扰RNAHOTAIR（si-HOTAIR）及阴性对照（si-NC）质粒通过Lipofectimine2000分别转染至胃癌细胞系SGC-7901、AGS中，构建异常表达的细胞株。转染后继续培养，应用G418抗生素筛选出稳定抑制表达的细胞株以及对照组。图2.2中A和B分别代表SGC-7901、AGS细胞在镜下的转染si-HOTAIR质粒效果图，在荧光倒置显微镜下观察到大量红色荧光则代表携带有红色荧光蛋白si-HOTAIR质粒转染成功并可在细胞内进行复制。因此我们可通过镜下红色荧光的表达情况观察转染效率，其后通过qRT-PCR检测转染后两组细胞中HOTAIR的表达量，结果如图2.2C所示，在转染后的SGC-7901和AGS细胞中HOTAIR的表达水平与对照组相比明显下降（P<0.01），转染效率达到90％以上。图2.2转染效果检测A、SGC-7901转染效果图B、AGS转染效果图C、qRT-PCR检测转染后HOTAIR的表达。注：**表示P<0.01。17
2.3下调HOTAIR的表达对胃癌细胞的增殖、迁移侵袭及凋亡能力的影响2.3.1下调HOTAIR的表达抑制胃癌细胞的增殖能力为检测下调LncRNAHOTAIR的表达对胃癌细胞增殖能力的影响，首先我们通过CCK-8实验检测抑制HOTAIR表达后的对数生长期胃癌细胞（SGC-7901、AGS）分别在0h、24h、48h、72h、96h各时间点的增殖情况（即A450处的OD值）。如图2.3.1-1所示，经重复测量方差分析结果显示，在两种胃癌细胞系（SGC-7901、AGS）中，与阴性对照组相比，si-HOTAIR组细胞的OD值均显著降低（P<0.001），差异具有统计学意义。由此可见，抑制HOTAIR的表达可抑制胃癌细胞的增殖能力，提示HOTAIR的表达与胃癌细胞增殖能力呈正相关关系。图2.3.1-1CCK-8检测转染si-HOTAIR后胃癌细胞的增殖情况A、SGC-7901各时间点增殖情况B、AGS各时间点增殖情况。注：***表示P<0.001。接下来，我们通过细胞克隆形成实验进一步检测胃癌细胞的集落形成能力与增殖能力。将转染后的单个肿瘤细胞连续培养10-14天至肉眼可观察到细胞集落形成后终止，此时计算细胞克隆形成数量。如图2.3.1-2所示，在两种胃癌细胞系（SGC-7901、AGS）中，与阴性对照组相比，si-HOTAIR组细胞的克隆形成数量显著降低（P<0.01），差异具有统计学意义。18
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同放射敏感性食管癌细胞株长链非编码RNA HOTAIR表达水平的分析[J]. 叶婷,李皓,陈瑞,邢瑶,周贤静,刘阳晨. 临床与实验病理学杂志. 2019(06)
[2]长链非编码RNA HOTAIR在结直肠癌中的表达、临床意义及预后分析[J]. 武雪亮,杨东东,王立坤,何琨. 实用医学杂志. 2019(09)
[3]Incidence and mortality of stomach cancer in China,2014[J]. Lei Yang,Rongshou Zheng,Ning Wang,Yannan Yuan,Shuo Liu,Huichao Li,Siwei Zhang,Hongmei Zeng,Wanqing Chen. Chinese Journal of Cancer Research. 2018(03)
[4]2014年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析[J]. 陈万青,孙可欣,郑荣寿,张思维,曾红梅,邹小农,赫捷. 中国肿瘤. 2018(01)
[5]Clinical significance of HOTAIR expression in colon cancer[J]. Zhi-Fen Luo,Dan Zhao,Xi-Qing Li,Yong-Xia Cui,Ning Ma,Chuang-Xin Lu,Ming-Yue Liu,Yun Zhou. World Journal of Gastroenterology. 2016(22)
[6]Competing endogenous RNA networks and gastric cancer[J]. Lei-Lei Guo,Chun-Hua Song,Peng Wang,Li-Ping Dai,Jian-Ying Zhang,Kai-Juan Wang. World Journal of Gastroenterology. 2015(41)
[7]Non-coding RNAs and gastric cancer[J]. Pei-Fei Li,Sheng-Can Chen,Tian Xia,Xiao-Ming Jiang,Yong-Fu Shao,Bing-Xiu Xiao,Jun-Ming Guo. World Journal of Gastroenterology. 2014(18)
[8]中国胃癌发病率及死亡率研究进展[J]. 邹文斌,李兆申. 中国实用内科杂志. 2014(04)
本文编号：3500672
【文章来源】：蚌埠医学院安徽省
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
LncRNAHOTAIR胃癌组织（A）及胃癌细胞（B）中的表达情况
2.2质粒转染及构建异常表达细胞株将小干扰RNAHOTAIR（si-HOTAIR）及阴性对照（si-NC）质粒通过Lipofectimine2000分别转染至胃癌细胞系SGC-7901、AGS中，构建异常表达的细胞株。转染后继续培养，应用G418抗生素筛选出稳定抑制表达的细胞株以及对照组。图2.2中A和B分别代表SGC-7901、AGS细胞在镜下的转染si-HOTAIR质粒效果图，在荧光倒置显微镜下观察到大量红色荧光则代表携带有红色荧光蛋白si-HOTAIR质粒转染成功并可在细胞内进行复制。因此我们可通过镜下红色荧光的表达情况观察转染效率，其后通过qRT-PCR检测转染后两组细胞中HOTAIR的表达量，结果如图2.2C所示，在转染后的SGC-7901和AGS细胞中HOTAIR的表达水平与对照组相比明显下降（P<0.01），转染效率达到90％以上。图2.2转染效果检测A、SGC-7901转染效果图B、AGS转染效果图C、qRT-PCR检测转染后HOTAIR的表达。注：**表示P<0.01。17
2.3下调HOTAIR的表达对胃癌细胞的增殖、迁移侵袭及凋亡能力的影响2.3.1下调HOTAIR的表达抑制胃癌细胞的增殖能力为检测下调LncRNAHOTAIR的表达对胃癌细胞增殖能力的影响，首先我们通过CCK-8实验检测抑制HOTAIR表达后的对数生长期胃癌细胞（SGC-7901、AGS）分别在0h、24h、48h、72h、96h各时间点的增殖情况（即A450处的OD值）。如图2.3.1-1所示，经重复测量方差分析结果显示，在两种胃癌细胞系（SGC-7901、AGS）中，与阴性对照组相比，si-HOTAIR组细胞的OD值均显著降低（P<0.001），差异具有统计学意义。由此可见，抑制HOTAIR的表达可抑制胃癌细胞的增殖能力，提示HOTAIR的表达与胃癌细胞增殖能力呈正相关关系。图2.3.1-1CCK-8检测转染si-HOTAIR后胃癌细胞的增殖情况A、SGC-7901各时间点增殖情况B、AGS各时间点增殖情况。注：***表示P<0.001。接下来，我们通过细胞克隆形成实验进一步检测胃癌细胞的集落形成能力与增殖能力。将转染后的单个肿瘤细胞连续培养10-14天至肉眼可观察到细胞集落形成后终止，此时计算细胞克隆形成数量。如图2.3.1-2所示，在两种胃癌细胞系（SGC-7901、AGS）中，与阴性对照组相比，si-HOTAIR组细胞的克隆形成数量显著降低（P<0.01），差异具有统计学意义。18
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同放射敏感性食管癌细胞株长链非编码RNA HOTAIR表达水平的分析[J]. 叶婷,李皓,陈瑞,邢瑶,周贤静,刘阳晨. 临床与实验病理学杂志. 2019(06)
[2]长链非编码RNA HOTAIR在结直肠癌中的表达、临床意义及预后分析[J]. 武雪亮,杨东东,王立坤,何琨. 实用医学杂志. 2019(09)
[3]Incidence and mortality of stomach cancer in China,2014[J]. Lei Yang,Rongshou Zheng,Ning Wang,Yannan Yuan,Shuo Liu,Huichao Li,Siwei Zhang,Hongmei Zeng,Wanqing Chen. Chinese Journal of Cancer Research. 2018(03)
[4]2014年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析[J]. 陈万青,孙可欣,郑荣寿,张思维,曾红梅,邹小农,赫捷. 中国肿瘤. 2018(01)
[5]Clinical significance of HOTAIR expression in colon cancer[J]. Zhi-Fen Luo,Dan Zhao,Xi-Qing Li,Yong-Xia Cui,Ning Ma,Chuang-Xin Lu,Ming-Yue Liu,Yun Zhou. World Journal of Gastroenterology. 2016(22)
[6]Competing endogenous RNA networks and gastric cancer[J]. Lei-Lei Guo,Chun-Hua Song,Peng Wang,Li-Ping Dai,Jian-Ying Zhang,Kai-Juan Wang. World Journal of Gastroenterology. 2015(41)
[7]Non-coding RNAs and gastric cancer[J]. Pei-Fei Li,Sheng-Can Chen,Tian Xia,Xiao-Ming Jiang,Yong-Fu Shao,Bing-Xiu Xiao,Jun-Ming Guo. World Journal of Gastroenterology. 2014(18)
[8]中国胃癌发病率及死亡率研究进展[J]. 邹文斌,李兆申. 中国实用内科杂志. 2014(04)
本文编号：3500672
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