幽门螺杆菌CagA蛋白对胃癌细胞丝氨酸/苏氨酸激酶PIM2表达的调节作用
发布时间：2022-10-19 16:17
目的通过幽门螺杆菌（H.pylori）cagA基因敲除、细胞共培养实验及重组质粒转染细胞实验,探讨H.pylori CagA蛋白对胃癌上皮细胞丝氨酸/苏氨酸激酶PIM2表达的影响,为H.pylori致病机制和胃癌诊疗研究提供基础。方法1.H.pylori cagA 基因敲除菌株的构建:（1）PCR扩增H.pylori NCTC11637菌株cagA基因上下游同源臂片段和质粒pNZ8110氯霉素抗性基因片段,应用无缝克隆技术将这些片段插入质粒pBluescript Ⅱ SK（-）构建cagA基因打靶载体,用PCR、酶切和测序法鉴;重组质粒;（2）通过电转化将打靶载体转入NCTC111637,运用含氯霉素培养板筛选阳性转化菌株,经PCR、基因测序和Western blot检测鉴定cagA基因敲除菌株NCTC11637△cagA。2.H.pylori与胃癌细胞共培养实验:（1）将H.pylori NCTC11637分别与胃癌上皮细胞HGC27、SGC7901和AGS共培养实验,检测当感染复数（Multiplicity of infection,MOI）,即细菌数:细胞数,分别为50:1、10...
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词
1 前言
2 材料与方法
2.1 主要仪器设备
2.2 主要生化试剂
2.3 试剂配制
2.3.1 菌株、质粒和细胞
2.3.2 主要试剂及配制
2.4 实验方法
2.4.1 技术路线图
2.4.2 H.pylori NCTC11637的培养鉴定及基因组DNA的提取
2.4.3 H.pylori NCTC11637 cagA基因打靶载体的构建
2.4.4 H.pylori NCTC11637 cagA基因敲除菌株的构建及鉴定
2.4.5 H.pylori NCTC11637 cagA基因真核表达载体的构建
2.4.6 细胞复苏、培养传代和冻存
2.4.7 H.pylori与细胞共培养实验
2.4.8 pcDNA-cagA真核质粒转染细胞实验
2.4.9 qPCR检测细胞PIM2 mRNA的表达
2.5 统计学分析
3 结果
3.1 打靶载体的构建及鉴定
3.1.1 NCTC11637 cagA基因上下游同源臂F1、F2 PCR结果
3.1.2 质粒pNZ8110氯霉素抗性基因cm~R PCR结果
3.1.3 打靶载体PCR和酶切鉴定结果
3.1.4 打靶载体测序结果
3.2 H.pylori cagA基因敲除菌株的鉴定
3.2.1 H.pylori菌体尿素酶鉴定和革兰染色结果
3.2.2 敲除菌株PCR和测序鉴定
3.2.3 敲除菌株Western Blot鉴定
3.3 H.pylori cagA基因真核表达载体的构建
3.3.1 H.pylori NCTC111637 cagA基因PCR结果
3.3.2 重组质粒pcDNA-cagA PCR鉴定
3.3.3 重组质粒pcDNA-cagA测序鉴定
3.4 H.pylori感染胃黏膜上皮细胞
3.4.1 H.pylori感染胃上皮细胞不同MOI细胞PIM2的表达
3.4.2 H.pylori感染胃上皮细胞不同时间细胞PIM2的表达
3.4.3 NCTC11637和NCTC11637△cagA菌株感染胃癌细胞PIM2的表达
3.5 pcDNA-cagA转染胃癌细胞
3.5.1 pcDNA-cagA转染胃上皮细胞后cagA基因的表达
3.5.2 pcDNA-cagA转染胃上皮细胞后细胞PIM2的表达
4 讨论
4.1 H.pylori NCTC11637 cagA基因敲除菌株的构建
4.2 H.pylori感染与胃癌细胞中PIM2表达的关系
4.3 H.pylori CagA蛋白与胃癌细胞中PIM2表达的影响
5 创新与局限
6 结论
7 参考文献
综述 丝氨酸/苏氨酸激酶PIM2的研究进展
参考文献
个人简历
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]幽门螺杆菌Tipα通过激活IL-6/STAT3信号通路诱导胃癌细胞EMT的形成[J]. 韩亮,陈国栋,曾莎莎,肖玲巧,张洁雅,赵兰华,蔡恒玲,张艳. 免疫学杂志. 2019(02)
[2]基因组编辑技术的原理及应用[J]. 贺飞燕,闫建俊,冯瑞云,张爱萍,张维锋,白云凤. 应用与环境生物学报. 2016(02)
[3]核因子κB信号转导通路与肿瘤关系的研究进展[J]. 崔哲浩,玄云泽. 世界最新医学信息文摘. 2015(21)
[4]幽门螺杆菌对胃癌上皮细胞株AGS细胞的生长抑制作用及其分子机理探讨[J]. 高文,胡伏莲,吕有勇. 中华医学杂志. 2003(09)
博士论文
[1]幽门螺杆菌CagA蛋白调控α-烯醇酶表达的机制[D]. 陈帅印.郑州大学 2014
[2]幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白（CagA）致病的分子机制研究[D]. 黄志刚.郑州大学 2007
硕士论文
[1]PIM2在人类红系发育中的功能研究[D]. 杨灿.郑州大学 2019
[2]幽门螺杆菌CagA与YWHAE相互作用对细胞迁移的影响[D]. 郑淑蓉.福建医科大学 2015
[3]幽门螺杆菌基因敲除方法的建立及其应用研究[D]. 韩秀萍.华中农业大学 2010
本文编号：3693692
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词
1 前言
2 材料与方法
2.1 主要仪器设备
2.2 主要生化试剂
2.3 试剂配制
2.3.1 菌株、质粒和细胞
2.3.2 主要试剂及配制
2.4 实验方法
2.4.1 技术路线图
2.4.2 H.pylori NCTC11637的培养鉴定及基因组DNA的提取
2.4.3 H.pylori NCTC11637 cagA基因打靶载体的构建
2.4.4 H.pylori NCTC11637 cagA基因敲除菌株的构建及鉴定
2.4.5 H.pylori NCTC11637 cagA基因真核表达载体的构建
2.4.6 细胞复苏、培养传代和冻存
2.4.7 H.pylori与细胞共培养实验
2.4.8 pcDNA-cagA真核质粒转染细胞实验
2.4.9 qPCR检测细胞PIM2 mRNA的表达
2.5 统计学分析
3 结果
3.1 打靶载体的构建及鉴定
3.1.1 NCTC11637 cagA基因上下游同源臂F1、F2 PCR结果
3.1.2 质粒pNZ8110氯霉素抗性基因cm~R PCR结果
3.1.3 打靶载体PCR和酶切鉴定结果
3.1.4 打靶载体测序结果
3.2 H.pylori cagA基因敲除菌株的鉴定
3.2.1 H.pylori菌体尿素酶鉴定和革兰染色结果
3.2.2 敲除菌株PCR和测序鉴定
3.2.3 敲除菌株Western Blot鉴定
3.3 H.pylori cagA基因真核表达载体的构建
3.3.1 H.pylori NCTC111637 cagA基因PCR结果
3.3.2 重组质粒pcDNA-cagA PCR鉴定
3.3.3 重组质粒pcDNA-cagA测序鉴定
3.4 H.pylori感染胃黏膜上皮细胞
3.4.1 H.pylori感染胃上皮细胞不同MOI细胞PIM2的表达
3.4.2 H.pylori感染胃上皮细胞不同时间细胞PIM2的表达
3.4.3 NCTC11637和NCTC11637△cagA菌株感染胃癌细胞PIM2的表达
3.5 pcDNA-cagA转染胃癌细胞
3.5.1 pcDNA-cagA转染胃上皮细胞后cagA基因的表达
3.5.2 pcDNA-cagA转染胃上皮细胞后细胞PIM2的表达
4 讨论
4.1 H.pylori NCTC11637 cagA基因敲除菌株的构建
4.2 H.pylori感染与胃癌细胞中PIM2表达的关系
4.3 H.pylori CagA蛋白与胃癌细胞中PIM2表达的影响
5 创新与局限
6 结论
7 参考文献
综述 丝氨酸/苏氨酸激酶PIM2的研究进展
参考文献
个人简历
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]幽门螺杆菌Tipα通过激活IL-6/STAT3信号通路诱导胃癌细胞EMT的形成[J]. 韩亮,陈国栋,曾莎莎,肖玲巧,张洁雅,赵兰华,蔡恒玲,张艳. 免疫学杂志. 2019(02)
[2]基因组编辑技术的原理及应用[J]. 贺飞燕,闫建俊,冯瑞云,张爱萍,张维锋,白云凤. 应用与环境生物学报. 2016(02)
[3]核因子κB信号转导通路与肿瘤关系的研究进展[J]. 崔哲浩,玄云泽. 世界最新医学信息文摘. 2015(21)
[4]幽门螺杆菌对胃癌上皮细胞株AGS细胞的生长抑制作用及其分子机理探讨[J]. 高文,胡伏莲,吕有勇. 中华医学杂志. 2003(09)
博士论文
[1]幽门螺杆菌CagA蛋白调控α-烯醇酶表达的机制[D]. 陈帅印.郑州大学 2014
[2]幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白（CagA）致病的分子机制研究[D]. 黄志刚.郑州大学 2007
硕士论文
[1]PIM2在人类红系发育中的功能研究[D]. 杨灿.郑州大学 2019
[2]幽门螺杆菌CagA与YWHAE相互作用对细胞迁移的影响[D]. 郑淑蓉.福建医科大学 2015
[3]幽门螺杆菌基因敲除方法的建立及其应用研究[D]. 韩秀萍.华中农业大学 2010
本文编号：3693692
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/3693692.html
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