溶瘤腺病毒介导双miRNAs表达对胰腺癌靶向治疗的研究

发布时间：2017-05-17 20:22

  本文关键词：溶瘤腺病毒介导双miRNAs表达对胰腺癌靶向治疗的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【研究背景和目的】胰腺癌恶性程度高,发病率逐年上升,死亡率居高不下,尚无特别有效的治疗方法。尽管近年来在医学影像学、新放化疗技术、免疫治疗等方面均取得了长足的进步,胰腺癌5年生存率依然低于5%。不断有研究指出,在胰腺导管腺癌(Pancreatic Du ctal Adenocarcinoma,PDAC)组织中microRNA(miRNA)的表达谱发生显著改变,调控相应靶基因的表达,在肿瘤的起始、进展等过程中发挥重要的作用,具有癌基因或抑癌基因样作用,可以调控肿瘤细胞周期、DNA损伤修复、细胞凋亡、肿瘤转移等多种生物学行为。目前,有研究通过质粒或病毒携带miRNA从而改变其在胰腺癌细胞中的表达,起到治疗肿瘤的作用。例如,有研究指出miR-34a和miR-let7在胰腺癌细胞中低表达,具有抑癌基因样作用。利用纳米粒子和CC9肽能够成功将具有抑癌作用的miR-34a转入PDAC细胞,从而抑制胰腺癌动物皮下移植瘤的生长。Torris ani等人则通过质粒或慢病毒携带miRNA从而提高miR-let7的表达,实现抑制PDA C细胞增殖的目的。尽管如此,针对单一miRNA的干预治疗对胰腺癌细胞生物学特性的抑制效果仍然有限,因此我们设想在增殖性溶瘤腺病毒的基础上同时克隆入具有抑癌作用的miR-34a和miR-let7,获得同时携带miR-34a和miR-let7的重组腺病毒治疗体系AdCEAp-miR34a-let7,在CEA启动子调控下介导肿瘤细胞高效表达和释放具有抑癌作用的miR-34a和miR-let7,发挥二者的协同抗肿瘤作用,实现对癌细胞的靶向干预治疗。【研究方法】1、腺病毒载体的构建及鉴定:以携带CEA启动子的Ad5F35嵌合型腺病毒为载体,分别克隆入具有抑癌作用的miR-34a和miR-let7基因序列,构建AdCEAp-miR34a-let7治疗体系,以及阳性对照组AdCEAp-miR34a和AdCEAp-miRlet7,同时构建携带绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的对照腺病毒AdCEAp-EGFP和Ad5-EGFP,并进行病毒基因组的鉴定。2、溶瘤腺病毒特异性增殖活性的鉴定:用AdCEAp-EGFP和Ad5-EGFP感染人胰腺癌细胞系Panc-1、Capa-2、SW1990、BxPC3及人正常成纤维细胞BJ、MRC-5细胞,荧光显微镜下观察计数EGFP阳性细胞比例及强度。另用AdCEAp-miR34a-let7、AdCEAp-miR34a、AdCEAp-miRlet7及Ad5-miR34a-let7感染上述细胞,经TCID50方法检测病毒滴度,Western Blotting方法检测腺病毒E1a基因表达。3、腺病毒介导miRNAs的表达:以MOI=1pfu/cell的强度感染腺病毒AdCEAp-mir34a-let7及ad5-mir34a-let7。抽提总mirna后经荧光实时定量rt-pcr法(qrt-pcr)检测mir-34a和mir-let7的表达。4、腺病毒介导双mirnas表达对胰腺癌细胞生物学行为的影响:以胰腺癌细胞系和正常成纤维细胞为研究对象,以moi=1pfu/cell强度感染adceap-mir34a-let7、adceap-mir34a、adceap-mirlet7及ad5-mir34a-let7,另设不加病毒的亲代细胞同步培养作为空白对照。通过四唑盐比色实验(mtt法)检测腺病毒介导双mirnas表达对胰腺癌细胞和正常成纤维细胞增殖活性的影响;通过transwell实验检测其对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;通过流式细胞术检测该治疗体系对胰腺癌细胞系凋亡能力的影响;提取细胞总蛋白后,采用westernblotting方法检测mir-34a和mir-let7相应靶蛋白以及信号分子的表达。5、动物模型实验:构建裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,瘤内注射上述治疗体系,观察并记录移植瘤生长情况,并绘制生长曲线,检测其对胰腺癌生长的抑制能力。【研究结果】1.腺病毒特异性增殖活性的鉴定:携带egfp报告基因的增殖腺病毒adceap-egfp在胰腺癌panc-1、capa-2、sw1990、bxpc3细胞中增殖明显,而在正常成纤维细胞bj、mrc-5细胞中无增殖。非增殖腺病毒ad5-egfp在所有细胞系中均不增殖。tcid50检测结果显示adceap-mir34a-let7、adceap-mir34a、adceap-mirlet7在4株胰腺癌细胞系中增殖明显,而在正常细胞系bj和mrc-5中不增殖。ad5-mir34a-let7在所有细胞系中均增殖不明显。e1a基因检测发现,adceap-mir34a-let7在panc-1、capa-2、sw1990、bxpc3细胞中阳性表达e1a,而在bj、mrc-5细胞中不表达。2.肿瘤特异性增殖腺病毒介导mirnas的表达:qrt-pcr检测证实腺病毒adceap-mir34a-let7介导mir-34a和mir-let7在胰腺癌细胞系中高水平表达,而在正常成纤维细胞系中则表达量极少。ad5-mir34a-let7在所有细胞系中表达mir-34a和let-7均处于低水平。3.肿瘤特异性增殖腺病毒介导的双mirnas表达对胰腺癌细胞增殖活性有抑制作用:mtt检测结果显示,在胰腺癌panc-1细胞及sw1990细胞中,adceap-mir34a-let7组与阴性对照组相比,肿瘤细胞增殖活性显著降低,差异有统计学意义(panc-1细胞p0.001,sw1990细胞p0.01);adceap-mir34a-let7组与adceap-mirlet7组相比,细胞增殖活性显著降低,差异有统计学意义(panc-1细胞p0.01,sw1990细胞p0.05);adceap-mir34a-let7组与adceap-mir34a组相比,差异无统计学意义(两种细胞均为p0.05)。4.肿瘤特异性增殖腺病毒介导的双mirnas表达对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力有抑制作用:transwell实验结果显示,adceap-mir34a-let7组相比adceap-mir34a组、adceap-mirlet7组、ad5-mir34a-let7组及空白对照组相比,前者胰腺癌细胞的侵袭能力及迁移能力均受到抑制。统计学分析结果显示,adceap-mir34a-let7组与adceap-mirlet7组及阴性对照组相比,细胞的迁移和侵袭能力均显著被抑制,差异有统计学意义(p0.01)。5.肿瘤特异性增殖腺病毒介导的双mirnas表达促进肿瘤细胞发生凋亡:流式细胞术分析显示,胰腺癌panc-1细胞在感染携带mirna的增殖性腺病毒后,其凋亡率均上升,其中adceap-mir34a-let7组与adceap-mirlet7组及ad5-mir34a-let7组相比,差异有统计学意义(p0.05);adceap-mir34a-let7组与adceap-mir34a组相比,差异无统计学意义(p=0.054)。6.肿瘤特异性增殖溶瘤腺病毒介导的双mirnas表达对胰腺癌细胞基因表达谱的影响:westernblotting方法检测结果可见adceap-mir34a-let7治疗组相比空白对照组,mir-34a的靶蛋白cyclins-d1、e2f1及bcl-2表达水平降低,差异有统计学意义,而cdk4未发现显著下降;mir-let7的靶蛋白hmga2及crd-bp表达水平降低,差异有统计学意义,而k-ras表达水平无显著降低。7.肿瘤特异性增殖溶瘤腺病毒介导的双mirnas表达对胰腺癌裸鼠移植瘤的生长有抑制作用:成功构建了裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型。其中,表达双mirna的adceap-mir34a-let7治疗组肿瘤生长速度明显低于其余各组,治疗21天后,adceap-mir34a-let7治疗组肿瘤体积并无明显上升,且有降低趋势;其次是adceap-mir34a和adceap-mirlet7组,非增殖腺病毒虽然表达双mirnas,但其抗肿瘤效果不理想。【研究结论】在本课题的研究中,我们利用cea启动子调控的肿瘤特异性增殖腺病毒载体的肿瘤特异性,携带两种具有抑癌作用的mirna,构建一种治疗体系,使其特异性作用于肿瘤细胞,发挥两种mirna的协同抗肿瘤作用。为胰腺癌的治疗提供了一种新的思路,主要结论有:1.成功构建了一种对胰腺癌细胞有抑制作用的以增殖性溶瘤腺病毒为载体的携带双mirnas的治疗系统adceap-mir34a-let7,该系统在胰腺癌细胞中特异性增殖,而在正常成纤维细胞中增殖不明显;在胰腺癌细胞中具有表达腺病毒e1a基因的能力,能在胰腺癌细胞系中高水平表达mir-34a及mir-let7,而在正常成纤维细胞中不表达,进一步说明该治疗系统的肿瘤细胞特异性,而对正常细胞无明显作用。2.腺病毒介导的双miRNAs表达对胰腺癌细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力均具有抑制作用,能够促进胰腺癌细胞凋亡,降低相关靶蛋白的表达水平,从而在细胞水平证实其治疗肿瘤的作用。3.肿瘤特异性增殖溶瘤腺病毒介导的双miRNAs表达对胰腺癌裸鼠移植瘤的生长有抑制作用。
【关键词】：腺病毒 miR-34a miR-let7 胰腺癌
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 英文缩写词表14-15
• 前言15-18
• 第一部分 同时表达miR-34a及miR-let7的肿瘤特异性增殖腺病毒载体的构建及鉴定18-28
• 一、材料与方法18-23
• 二、实验结果23-26
• 三、讨论26-28
• 第二部分 增殖性溶瘤腺病毒介导双mi RNAs表达对胰腺癌细胞生物学行为的影响28-41
• 一、材料和方法28-33
• 二、实验结果33-39
• 三、讨论39-41
• 第三部分 增殖性溶瘤腺病毒介导双mi RNAs治疗体系对胰腺癌裸鼠移植瘤的疗效研究41-46
• 一、材料和方法41-43
• 二、实验结果43-44
• 三、讨论44-46
• 全文小结46-48
• 参考文献48-53
• 综述：miRNA在胰腺癌发生、发展及临床应用中的研究进展53-63
• 参考文献58-63
• 在学期间发表的论文63-64
• 致谢64-65

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本文编号：374445