携带ING4和GMCSF的双基因溶瘤痘苗病毒体外治疗癌症的研究

发布时间：2017-05-18 11:04

  本文关键词：携带ING4和GMCSF的双基因溶瘤痘苗病毒体外治疗癌症的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Ⅰ.随着空气污染加剧促使环境的不断恶化,以及饮食、压力等多方面对机体的威胁,现在,癌症已经成为人类的头号杀手,是威胁人类健康的最主要疾病。由于治疗癌症的传统疗法受到多种原因限制,治疗效果并不理想并且毒副作用明显。随着医学科技的发展,治疗癌症的手段不断探索与更新,肿瘤的生物学疗法给患者带来了曙光。结合基因治疗和病毒治疗两种癌症疗法的优势而提出的“癌症的靶向基因-病毒治疗”策略对选择病毒载体和治疗基因的活性提出了新的靶标。基于此策略,我们利用安全性高、复制快和包装容量大等特点的痘苗病毒携带ING4和GM-CSF构建了一种新的癌症靶向基因-病毒。已知,ING4基因广泛参与肿瘤的发生发展过程,其抑癌功能包括抑制HIF-1的活性、增强P53基因的活性,从而促进肿瘤细胞死亡;GM-CSF是一种粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,能够激活机体的免疫系统来增强抗肿瘤效果。本研究以痘苗病毒为载体,使其携带ING4或GM-CSF两个治疗基因,从而包装出安全性高且杀伤效果显著的单基因溶瘤痘苗病毒OncoPox-ING4和Onco PoxGMCSF。重组痘苗病毒的构建将ING4和GMCSF两个基因插入到痘苗病毒pCB质粒载体的TK区,随后病毒和质粒在细胞内发生同源重组,目的基因将会插入到野生型痘苗病毒基因组,从而获得携带有双基因的OncoPox-ING4和OncoPoxGMCSF溶瘤痘苗病毒。构建的重组痘苗病毒OncoPox-ING4和OncoPox-GMCSF经大量扩增、纯化和滴度测定后感染细胞,经Western blot检测出有目的基因的蛋白表达。接着用重组痘苗病毒来杀伤肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌和脑胶质瘤等细胞,通过观察细胞的形态学变化、结晶紫染色分析病理学效应、Hoechst检测凋亡诱导作用、MTT试验检测细胞的存活率以及Western Blot检测相关蛋白的表达,结果表明溶瘤痘病毒OncoPox-ING4对几种癌细胞的诱导凋亡效果最显著,同时也验证了其可能是通过抑制NF-kB信号通路中的某一个环节来抑制肿瘤生长。因此,痘病毒OncoPox-ING4对杀伤癌细胞具有广谱性且抗癌作用显著,验证了“靶向基因病毒治疗策略”的合理性,为治疗癌症提供了新的方法。Ⅱ.目前,溶瘤腺病毒用于治疗癌症是一个热点。本课题研究目的是检测溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac联合SNS-032治疗胰腺癌的协同作用。体外试验表明了SNS-032能够增强ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的杀伤,诱导胰腺癌细胞的凋亡。Western blot试验表明SNS-032通过影响抗凋亡蛋白如CDK-2、CDK-9、Mcl-1、XIAP和Bcl-2等增强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌细胞凋亡作用。体内试验也证明了SNS-032能够促进ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的杀伤。本研究分别通过体内和体外试验证明,SNS-032能够加强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的杀伤,使其凋亡。试验数据表明,联合SNS-032和ZD55-TRAIL-IETD-Smac对于胰腺癌是个合理的治疗方法。
【关键词】：溶瘤痘病毒 溶瘤腺病毒 ING4 GMCSF SNS-032 癌症
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词8-11
• 第一章 携带ING4和GM-CSF双基因的溶瘤痘病毒体外治疗癌症的研究11-39
• 1.1 引言11-16
• 1.1.1 癌症治疗的研究现状11-12
• 1.1.2 癌症的基因治疗12
• 1.1.3 癌症的靶向-基因病毒治疗12-13
• 1.1.4 痘苗病毒包装的介绍13-16
• 1.2 试验材料与方法16-29
• 1.2.1 试验材料16-19
• 1.2.2 试验方法19-29
• 1.3 试验结果29-37
• 1.3.1 重组痘苗病毒目的基因的鉴定29-30
• 1.3.2 重组痘苗病毒目的基因和野毒的鉴定30-31
• 1.3.3 蛋白水平鉴定溶瘤痘苗病毒OncoPox-ING4和OncoPox-GMCSF的蛋白表达31-32
• 1.3.4 细胞形态学观察32
• 1.3.5 结晶紫染色分析重组痘苗病毒对PANC-1 细胞的病理学效应32-33
• 1.3.6 Hoechst33342检测重组溶瘤痘苗病毒对BxPC-3 的凋亡诱导作用33-34
• 1.3.7 MTT法检测重组痘病毒对癌细胞的杀伤效果34
• 1.3.8 Western Blot分析表明溶瘤痘病毒OncoPox-ING4可能通过抑制NF-kB信号通路抑制肿瘤生长34-37
• 1.4 讨论37-38
• 1.5 结论38-39
• 第二章 CDK抑制剂SNS-032联合溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac协同抑制胰腺癌的研究39-52
• 2.1 引言39-41
• 2.2 试验材料41
• 2.2.1 细胞和试剂41
• 2.2.2 病毒41
• 2.3 试验方法41-43
• 2.3.1 腺病毒ZD55- TRAIL-IETD-Smac的大量纯化及病毒滴度测定41
• 2.3.2 MTT检测细胞存活率41-42
• 2.3.3 Hoechst3334染色观察肿瘤细胞的凋亡42
• 2.3.4 流式分析细胞凋亡42
• 2.3.5 Western blot分析42-43
• 2.3.6 动物试验43
• 2.3.7 统计分析43
• 2.4 试验结果43-50
• 2.4.1 SNS-032增强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的生长抑制43-46
• 2.4.2 SNS-032增强ZD55-TRAIL-IETD-Smac诱导的胰腺癌细胞凋亡46-48
• 2.4.3 SNS-032联合ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌细胞凋亡有协同作用48-49
• 2.4.4 SNS-032协同ZD55-TRAIL-IETD-Smac体内抑制胰腺癌细胞的增殖49
• 2.4.5 SNS-032协同ZD55-TRAIL-IETD-Smac体内抗癌效果显著49-50
• 2.5 讨论50-51
• 2.6 结论51-52
• 参考文献52-58
• 研究生期间的研究成果58-59
• 致谢59

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