靶向阻断PD-1/PD-L1通路在NSCLC免疫治疗中的应用

发布时间：2023-03-18 18:55

　　研究背景免疫检查点是一类免疫系统调节分子,参与自身耐受,防止自身攻击和免疫过度。免疫检查点分为激活型和抑制型两类。抑制型免疫检查点在肿瘤微环境中常被肿瘤细胞所利用,抑制免疫细胞活性,实现免疫逃逸,常见于活化的T淋巴细胞抑制型免疫检查点包括PD-1(CD279)、CTLA-4(CD152)、LAG3(CD223)、TIM-3(CD366)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)等。细胞程序性死亡受体(PD-1),在死亡诱导过程中起到重要的作用。PD-1与配体的结合上调E3-泛素连接酶CBL-b和c-CBL,触发T细胞受体下调,抑制T细胞的活化及细胞因子的释放。PD-L1低表达于活化的T细胞、树突状细胞、B细胞、单核细胞、角质形成细胞等。在非小细胞肺癌中也见到PD-L1的高表达。在肿瘤微环境中,PD-L1通过失活细胞毒性T细胞来为肿瘤细胞提供免疫逃逸,有报道显示PD-L1可以作为肿瘤免疫治疗的预测性指标。据2015年统计,中国最常见的癌症肺癌,也是中国癌症相关死亡的主要原因,紧随其后的是胃癌、食管癌和肝癌。非小细胞肺癌约占肺癌病例的80-85%。与小细胞肺癌相比,非小细胞肺癌对化疗不敏感,主要...

【文章页数】：144 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第1章 文献综述
    1.1 免疫检查点研究进展
        1.1.1 程序性死亡受体PD-1及配体
        1.1.2 其他抑制性免疫检查点
    1.2 NSCLC治疗的研究进展
    1.3 CAR-T在免疫治疗中的应用
    1.4 CRISPR/Cas9在肿瘤治疗中的应用
    1.5 本课题研究目标、内容与特色
        1.5.1 研究目标
        1.5.2 研究内容
        1.5.3 研究特色与意义
第2章 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞
        2.1.2 主要试剂与耗材
        2.1.3 流式抗体
        2.1.4 主要试剂的配制
        2.1.5 载体质粒
        2.1.6 引物序列
        2.1.7 主要实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 抗体的标记
        2.2.2 标记抗体的检测
        2.2.3 蛋白浓度测定
        2.2.4 多肽冲击PBMC
        2.2.5 流式检测PD-1表达情况
        2.2.6 流式检测PD-1单抗药物与PBMC的结合情况
        2.2.7 温度和时间对PD-1抗体体外封闭的影响
        2.2.8 肿瘤细胞表达的PD-L1对体外封闭的影响
        2.2.9 PBMC与NCI-H358的共培养
        2.2.10 流式检测共培养的PBMC CD8+、CD4+和PD-1+
        2.2.11 LDH法检测PBMC杀伤效果
        2.2.12 表达载体的构建
        2.2.13 慢病毒包装
        2.2.14 慢病毒浓缩
        2.2.15 慢病毒滴度测定
        2.2.16 慢病毒感染PBMC
        2.2.17 慢病毒感染效率的测定
        2.2.18 流式检测细胞凋亡
        2.2.19 细胞因子的检测—ELISA检测法
        2.2.20 流式细胞分型
        2.2.21 CRISPR敲除载体的构建
        2.2.22 流式检测CRISPR敲除效率
        2.2.23 流式检测PBMC CRISPR靶基因敲除效率
        2.2.24 统计学分析
第3章 结果
    3.1 PD-1单抗分子的组成及标记
        3.1.1 SDS-PAGE分析PD-1单抗药
        3.1.2 PD-1单抗药的荧光标记
        3.1.3 标记的PD-1单抗药检测PBMC上PD-1的表达情况
        小结
    3.2 淋巴细胞培养过程中PD-1+细胞比例的变化
        3.2.1 多肽冲击共培养过程中PD-1+细胞比例的变化
        3.2.2 PBMC与肿瘤细胞共培养过程中PD-1+细胞比例的变化
        小结
    3.3 PD-1单抗药对PBMC的封闭效果
        3.3.1 PD-1抗体药物在pH5.8、pH6.6、pH7.2和pH8.0的缓冲体系中结合情况
        3.3.2 PD-1抗体药物在pH 6.6、pH6.8和pH7.4的缓冲体系中结合情况
        3.3.3 pH值降低后,已结合的PD-1抗体药物是否会解离
        3.3.4 在原pH值条件下结合的稳定性分析
        小结
    3.4 体外封闭后遇到肿瘤细胞上的PD-L1是否会解离
        3.4.1 细胞因子刺激对K562细胞PD-L1表达水平的影响
        3.4.2 细胞因子刺激对A549细胞PD-L1表达水平的影响
        3.4.3 细胞因子刺激对NCI-H358细胞PD-L1表达水平的影响
        3.4.4 荧光扫描仪检测体外封闭情况
        3.4.5 PD-L1表达肿瘤细胞对体外封闭的影响
        3.4.6 PD-L1高表达肿瘤细胞对体外封闭的影响
    3.5 PD-1单抗药体外封闭时间和温度对封闭效率的影响
        3.5.1 封闭温度、封闭时间对封闭情况的影响
        3.5.2 PBS体系中25℃ 1h的封闭情况
        3.5.3 PBS体系中25℃ 2h的封闭情况
        3.5.4 PBS体系中37℃ 1h的封闭情况
        3.5.5 不同温度、时间和封闭条件的比较
        小结
    3.6 培养液OKM200+5%FBS或生理盐水作为封闭环境
        3.6.1 在细胞培养基中37℃1h的封闭情况
        3.6.2 PBMC在0.9% NaCl中的封闭情况
        小结
    3.7 80%左右的封闭效果是否会影响PBMC的杀伤活性
        3.7.1 体外封闭对PBMC杀伤效果的影响——LDH法
        小结
    3.8 PD-L1嵌合抗原受体的表达
        3.8.1 PD-L1抗体慢病毒表达载体的构建
        3.8.2 转染体系的确定
        3.8.3 慢病毒滴度的测定
        3.8.4 慢病毒感染PBMC
        3.8.5 PBMC表达PD-L1嵌和抗原抗体
        小结
    3.9 PBMC培养条件的确定
        3.9.1 活化条件对PBMC组分的影响
        3.9.2 CAR-T细胞体外扩增
        小结
    3.10 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
        3.10.1 表达PD-L1 scFv-28Bz的PBMC对NCI-H358的杀伤作用
        3.10.2 表达PD-L1 scFv-28Bz的PBMC对A549(PD-L1低表达)的杀伤效果
        3.10.3 CD8+、CD4+及PD-1+的细胞比例
        3.10.4 共培养上清中细胞因子水平
        小结
    3.11 基于CRISPR/Cas9方法的免疫检查点敲除位点筛选
        3.11.1 肿瘤患者免疫检查点表达水平的多样性
        3.11.2 293TN细胞PD-1等免疫检查点的表达情况
        3.11.3 293TN细胞PD-1等免疫检查点过表达细胞系的建立
        3.11.4 基于慢病毒载体CRISPR-GFP的PD-1敲除载体的构建
        3.11.5 PD-1敲除靶点的筛选
        3.11.6 PBMC PD-1的敲除
        3.11.7 其它免疫检查点敲除靶点的筛选
        小结
第4章 讨论
    4.1 单克隆抗体封闭对杀伤的影响
    4.2 PD-L1 CAR-T对PD-L1高表达非小细胞肺癌的杀伤作用
    4.3 基于CRISPR/Cas9技术的免疫检查点敲除靶点的筛选
第5章 结论
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢
附件



本文编号：3763684