GPD1酶在毕赤酵母中的表达及纯化

发布时间：2023-03-23 04:01

　　目的构建可以分泌表达GPD1酶的毕赤酵母,并使用Profinia蛋白纯化系统获得纯度90%以上的GPD1酶,扩大GPD1酶的制备,以进一步研究其在肿瘤中的功能及作为抗肿瘤靶点的临床应用研究。方法提取人细胞的总RNA,逆转录成cDNA,以此为模板通过PCR扩增GPD1基因,PCR产物与表达载体pPICZα-C用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,连接构建重组表达质粒pPICZα-C-gpd1;pPICZα-C-gpd1质粒电转至毕赤酵母X-33中,筛选阳性转化子,经甲醇诱导表达,采用固化金属亲和层析(IMAC)纯化分泌的目的蛋白。结果经SDS-PAGE鉴定,成功表达和纯化了GPD1酶,纯度达90%以上。结论本研究建立了毕赤酵母分泌表达GPD1酶的方法,可用于制备GPD1酶,为进一步的肿瘤机制研究和应用研究奠定基础。

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【文章目录】：
1 材料和仪器
    1.1 材料
    1.2 仪器
2 方法
    2.1 GPD1基因的PCR扩增
    2.2 表达质粒pPICZα-C-gpd1的构建
    2.3 电击转化pPICZα-C-gpd1及阳性转化子的鉴定
    2.4 甲醇诱导毕赤酵母表达GPD1
    2.5 重组GPD1酶的纯化
    2.6 检测纯化蛋白的浓度
3 结果
    3.1 GPD1基因的PCR扩增结果
    3.2 重组表达质粒pPICZα-C-gpd1的构建及鉴定结果
    3.3 酵母阳性转化子的鉴定结果
    3.4 GPD1的表达和纯化
    3.5 GPD1重组酶的产量
4 讨论



本文编号：3768239