PRKAR2A-AS1通过miR-34a-5p和PKA通路介导的FOXP3表达和核转位调控胃癌增殖及其机制研究

发布时间：2023-04-09 22:44

　　目的:2018年全球约有100万新的胃癌病例和约70万死亡病例,其中约一半发生在中国。临床上根治性切除术受限于胃癌分期、胃癌发生的部位等,且无普遍适用的药物。迫切需要对胃癌的发生发展尤其是恶性增殖的过程进行深入研究。FOXP3转录因子被报道参与多种肿瘤的增殖和迁移等过程。FOXP3的功能与其在细胞内的定位和磷酸化(p-FOXP3)密切相关。我们及其他的研究发现FOXP3与胃癌的进展密切相关。FOXP3如何影响胃癌的增殖?FOXP3的表达调控模式是怎样的?细胞质中的FOXP3蛋白如何转位进入细胞核参与下游基因表达的调控?对这些问题进行深入研究可以加深对胃癌发生发展的理解,为胃癌的临床诊断和治疗提供可能的检测指标和药物靶点,并为此提供理论依据。材料和方法:利用PCR、定点突变技术和同源重组介导的连接构建各个基因的过表达或敲低质粒以及野生型和定点突变型的荧光素酶报告基因质粒。利用短发夹RNA(shRNA)结合慢病毒筛选稳定敲低内源性基因表达的胃癌细胞系。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(WB)检测各种基因的表达情况。利用CCK-8细胞活力测定和EdU细胞增殖测定检测胃癌细...

【文章页数】：111 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 胃癌的临床现状
        1.1.1 胃癌的流行病学
        1.1.2 胃癌的分类
        1.1.3 胃癌的致病因素
        1.1.4 胃癌的临床诊断和治疗
    1.2 胃癌与恶性增殖
    1.3 本课题的目的和意义
第2章 FOXP3调控胃癌增殖及其机制研究
    2.1 前言
        2.1.1 FOXP3的基因信息
        2.1.2 FOXP3与免疫
        2.1.3 FOXP3与肿瘤
        2.1.4 FOXP3调控的基因
    2.2 材料
        2.2.1 菌种
        2.2.2 质粒载体
        2.2.3 细胞系
        2.2.4 裸鼠
        2.2.5 试剂
        2.2.6 耗材
        2.2.7 仪器与设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 质粒构建
        2.3.2 质粒提取
        2.3.3 细胞培养
        2.3.4 细胞转染
        2.3.5 慢病毒包装及滴度测定
        2.3.6 稳定转染细胞筛选
        2.3.7 RNA提取和反转录(RT)
        2.3.8 实时荧光定量PCR(q RT-PCR)
        2.3.9 蛋白质提取和二辛可宁酸(BCA)法浓度测定
        2.3.10 蛋白质印迹法(WB)
        2.3.11 Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞活力测定
        2.3.12 5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖测定
        2.3.13 荧光素酶报告基因活性分析(luciferase assay)
        2.3.14 染色质免疫共沉淀(ChIP)
        2.3.15 裸鼠皮下成瘤
        2.3.16 数据统计分析
    2.4 结果
        2.4.1 FOXP3表达水平与胃癌的发生相关
        2.4.2 稳定敲低FOXP3在细胞水平促进胃癌增殖
        2.4.3 稳定敲低FOXP3在体内促进胃癌增殖
        2.4.4 稳定敲低FOXP3直接促进增殖相关基因的表达
        2.4.5 FOXP3直接靶向增殖相关基因的启动子抑制其转录活性
    2.5 讨论
第3章 PRKAR2A-AS1/PKR2 轴通过调控FOXP3 表达影响胃癌增殖
    3.1 前言
        3.1.1 MiRNA与胃癌
        3.1.2 Lnc RNA与胃癌
    3.2 材料
        3.2.1 菌种
        3.2.2 质粒载体
        3.2.3 细胞系
        3.2.4 裸鼠
        3.2.5 试剂
        3.2.6 耗材
        3.2.7 仪器与设备
    3.3 方法
        3.3.1 质粒构建
        3.3.2 质粒提取
        3.3.3 细胞培养
        3.3.4 细胞转染
        3.3.5 Lentivirus包装及滴度测定
        3.3.6 稳定转染细胞筛选
        3.3.7 RNA提取和RT
        3.3.8 QRT-PCR
        3.3.9 蛋白质提取和BCA法浓度测定
        3.3.10 WB
        3.3.11 CCK-8细胞活力测定
        3.3.12 EdU细胞增殖测定
        3.3.13 luciferase assay
        3.3.14 RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)
        3.3.15 裸鼠皮下成瘤
        3.3.16 数据统计分析
    3.4 结果
        3.4.1 miR-34a-5p表达水平与胃癌的发生相关
        3.4.2 稳定敲低miR-34a-5p在细胞水平促进胃癌增殖
        3.4.3 稳定敲低miR-34a-5p在体内促进胃癌增殖
        3.4.4 mi R-34a-5p通过靶向FOXP3的3'UTR调控其表达
        3.4.5 PRKAR2A-AS1 表达水平与胃癌的发生相关
        3.4.6 稳定敲低PRKAR2A-AS1 在细胞水平促进胃癌增殖
        3.4.7 稳定敲低PRKAR2A-AS1 在体内促进胃癌增殖
        3.4.8 PRKAR2A-AS1 通过竞争性结合mi R-34a-5p调控FOXP3 的表达
    3.5 讨论
第4章 PRKAR2A-AS1 通过PKA通路调控FOXP3 磷酸化介导其核转位
    4.1 前言
        4.1.1 核转运
        4.1.2 核转运异常与疾病
        4.1.3 FOXP3核定位及其功能
    4.2 材料
        4.2.1 菌种
        4.2.2 质粒载体
        4.2.3 细胞系
        4.2.4 裸鼠
        4.2.5 试剂
        4.2.6 耗材
        4.2.7 仪器与设备
    4.3 方法
        4.3.1 质粒构建
        4.3.2 质粒提取
        4.3.3 细胞培养
        4.3.4 细胞转染
        4.3.5 Lentivirus包装及滴度测定
        4.3.6 稳定转染细胞筛选
        4.3.7 RNA提取和RT
        4.3.8 QRT-PCR
        4.3.9 蛋白质提取和BCA法浓度测定
        4.3.10 WB
        4.3.11 免疫荧光(Immunofluorescence,IF)
        4.3.12 胞核/胞质分离
        4.3.13 数据统计分析
    4.4 结果
        4.4.1 FOXP3的亚细胞定位与胃癌的发生相关
        4.4.2 蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)通路抑制FOXP3 的磷酸化和核转位
        4.4.3 PRKAR2A-AS1 通过抑制PKA通路进而促进FOXP3 的磷酸化和核转位
        4.4.4 PRKAR2A-AS1与PKR2 直接结合
    4.5 讨论
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢
附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果
附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目



本文编号：3787863