NBPF15N端引起蛋白产生多种聚集体并介导相变及DDX43的体外酶学性质研究

发布时间：2023-08-30 04:00

　　神经母细胞瘤断点家族(Neuroblastoma Breakpoint Family,NBPF)拥有24个成员,该家族成员与神经母细胞瘤及其他癌症的发生相关,这是一个在人类进化谱系上新出现的基因,由N端及不同数量的Olduvai结构域组成。Olduvai结构域在人类谱系上经历了快速且大量地增长,在人类中拥有最高数量的302个拷贝,在小鼠中只有1个拷贝,而在非哺乳动物中不存在。研究发现Olduvai的拷贝数异常与大脑脑尺寸有关,并与正常及病变的人脑灰质体积及神经元数目相关,Olduvai拷贝数的增加与人类头大综合征及自闭症相关,而拷贝数的减少与头小综合征及精神分类症有关。Olduvai结构域在人体各个组织中都表达,尤其在大脑认知相关的区域中高表达,且显示出神经元特异性表达。除了生物信息学和统计学手段证明Olduvai结构域在进化上和大脑认知型疾病相关以外,对Olduvai结构域及N端的生化性质一无所知。NBPF15含有长度超过100个氨基酸的N端和6个不同亚型的Olduvai结构域。我们在体外合成了NBPF15核苷酸序列,通过酶切连接构建在不同的表达载体中,并进行了 NBPF15全长及截...

【文章页数】：129 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 NBPF15的研究历史与进展
        1.1.1 Olduvai结构域与NBPF基因
        1.1.2 Olduvai结构域在人类基因组上的拷贝数分析及特点
        1.1.3 Olduvai结构域与疾病
        1.1.4 Olduvai与其他基因的联系
        1.1.5 NBPF基因
        1.1.6 神经退行性疾病与相变
        1.1.7 相变与疾病、衰老及病理学研究
    1.2 DDX43的研究历史与进展
        1.2.1 DEAD-box RNA解旋酶
        1.2.2 解旋酶DDX43
    1.3 本文的研究目的与意义
        1.3.1 NBPF15研究的目的与意义
        1.3.2 DDX43研究的目的与意义
第二章 NBPF15实验设备、材料及方法
    2.1 实验设备
    2.2 实验试剂
        2.2.1 主要生化试剂
        2.2.2 溶液配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 全长及截短蛋白的构建
        2.3.2 蛋白的小样表达纯化
        2.3.3 蛋白的大样表达纯化
        2.3.4 蛋白二三级结构预测
        2.3.5 蛋白聚集状态测定
        2.3.6 蛋白均一性测定
        2.3.7 小角衍射(SAXS)和圆二色谱(CD)实验
        2.3.8 透射电子显微镜和微分差干涉显微镜观察
        2.3.9 单蛋白的结晶筛选
第三章 NBPF15结果与分析
    3.1 NBPF15蛋白的体外表达和纯化
        3.1.1 NBPF15全长及截短蛋白的表达
        3.1.2 NBPF15截短蛋白的纯化
    3.2 NBPF15截短蛋白聚集性质的分析
        3.2.1 第一类蛋白拥有多种聚集状态
        3.2.2 第二类蛋白拥有两种或者三种聚集状态
        3.2.3 第三类蛋白拥有单一聚集状态
    3.3 含有N端的NBPF15蛋白的基本生化性质
        3.3.1 SEC-SAXS研究NBPF15蛋白
        3.3.2 CD研究NBPF15蛋白
        3.3.3 TEM观察不同的NBPF15截短蛋白
        3.3.4 使用在线软件预测NBPF15蛋白的有序性
    3.4 NBPF15N端蛋白的相变
    3.5 小结
第四章 DDX43实验材料和方法
    4.1 DDX43表达载体的构建
        4.1.1 pET-15b-Sumo-DDX43质粒的构建
        4.1.2 DDX43截短及中间引入3C酶切位点的质粒构建
    4.2 pET-15b-Sumo-DDX43的蛋白纯化
    4.3 基于荧光各向异性值的蛋白与底物结合实验
    4.4 DDX43及其截短蛋白解旋活力的测定
    4.5 DDX43的蛋白酶消化实验
    4.6 DDX43及其截短蛋白结晶底物与条件的筛选
        4.6.1 单蛋白结晶点样
        4.6.2 蛋白与底物复合结晶筛选
第五章 DDX43结果与分析
    5.1 DDX43蛋白的体外表达
    5.2 DDX43全长蛋白与底物亲和力的测定
    5.3 DDX43截短蛋白与底物亲和力的测定
        5.3.1 酶标仪检测DDX43截短蛋白与底物的亲和力
        5.3.2 DDX43结合底物的主要结构域
    5.4 DDX43的解旋活性
    5.5 DDX43蛋白酶消化实验
    5.6 DDX43的结晶筛选
    5.7 小结
第六章 讨论与展望
    6.1 NBPF15实验的讨论与展望
    6.2 DDX43实验的讨论与展望
参考文献
主要符号对照表
附录
致谢
个人简历



本文编号：3844881