抑癌基因ARHI对BGC823胃癌细胞自噬、侵袭转移的影响及机制研究

发布时间：2023-10-29 10:15

　　目的:胃癌是常见的恶性肿瘤,常常在诊断时发现存在远处转移。胃癌治疗失败常常是广泛侵袭和远处转移所引起的,就是说这种侵袭、转移是主要的治疗失败模式,也是患者主要的死因也是侵袭和转移。因此,提高胃癌整体治疗结局的关键在于阐明胃癌发生侵袭转移的机制并建立控制侵袭转移的有效方法。ARHI是1999年发现的母源性印记抑癌基因,以往研究发现在多种恶性肿瘤中ARHI表达下调,并且参与抑制增殖、抑制迁移、调控细胞周期等。目前,ARHI与胃癌自噬以及侵袭转移关系的系统研究尚未见报告。本研究拟构建ARHI再表达胃癌细胞株,采用体外细胞学实验观察评估ARHI基因对胃癌细胞增殖、自噬、凋亡、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响;采用裸鼠荷瘤模型实验评估ARHI基因对胃癌细胞皮下移植瘤生长及血行播散转移的影响,并探讨相关分子机制,旨在系统完整地阐释ARHI基因调控胃癌细胞生物学行为的作用机制,客观评估其作为抗胃癌侵袭转移治疗新靶点的价值。材料和方法:1、构建ARHI基因稳定高表达胃癌细胞株。常规培养人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901、MKN-45、NCI-N87和人永生化胃粘膜上皮细胞株GES-1。采用R...

【文章页数】：101 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 ARHI基因再表达对BGC823胃癌细胞生物学行为的影响及机制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 材料与仪器
            2.1.1 主要材料
            2.1.2 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 多种细胞系中ARHI转录、翻译水平的检测
            2.2.2 稳定再表达ARHI基因胃癌细胞株ARHI-BGC823的建立
            2.2.3 稳定高表达ARHI基因胃癌细胞株ARHI-BGC823的鉴定
            2.2.4 ARHI基因过表达对胃癌细胞BGC823生物学行为的影响
            2.2.5 ARHI基因对BGC823胃癌细胞系调控机制的探索
        2.3 统计学方法
    3 结果
        3.1 正常胃粘膜上皮细胞及胃癌细胞系中ARHI转录、翻译水平
            3.1.1 正常胃粘膜上皮细胞及4种胃癌细胞系中ARHI转录水平
            3.1.2 胃癌细胞系中ARHI蛋白表达水平
            3.1.3 ARHI蛋白在正常胃粘膜上皮细胞及4种胃癌细胞中表达
        3.2 稳定高表达ARHI基因胃癌细胞株ARHI-BGC823的建立
            3.2.1 ARHI质粒、空载质粒的鉴定
            3.2.2 ARHI质粒瞬时转染效率评价
            3.2.3 稳定转染细胞系的建立
        3.3 稳定高表达ARHI基因胃癌细胞株ARHI-BGC823的鉴定
            3.3.1 稳定转染细胞系绿色荧光标签蛋白表达
            3.3.2 稳定转染细胞系中ARHImRNA转录水平
            3.3.3 稳定转染细胞系中ARHI蛋白表达水平
            3.3.4 稳定转染细胞系中再表达ARHI蛋白的细胞内定位
        3.4 体外实验评估ARHI基因对胃癌细胞BGC823生物学行为的影响
            3.4.1 ARHI基因再表达可显著抑制胃癌细胞BGC823增殖活性
            3.4.2 ARHI基因再表达可诱导胃癌细胞BGC823凋亡
            3.4.3 ARHI再表达可诱导胃癌细胞的自噬
            3.4.4 ARHI基因过表达可抑制BGC823胃癌细胞的迁移能力
            3.4.5 ARHI基因过表达抑制胃癌细胞BGC823的侵袭能力
        3.5 ARHI基因过表达影响胃癌细胞生物学行为的机制探讨
            3.5.1 ARHI基因过表达诱导细胞周期G0/G1期阻滞
            3.5.2 ARHI下调ERK信号通路活性抑制细胞增殖、诱导凋亡
            3.5.3 ARHI再表达可能通过逆转EMT抑制细胞迁移、侵袭
            3.5.4 ARHI再表达可能通过下调SP1/VEGF抑制胃癌细胞诱导血管生成的能力
            3.5.5 ARHI可能通过下调PI3K-AKT-mTOR通路活性抑制恶性行为
            3.5.6 BGC823胃癌细胞ARHI失活的原因包括启动子甲基化和组蛋白去乙酰化
    4 讨论
    5 结论
第二部分 ARHI基因再表达对BGC823胃癌细胞裸鼠皮下成瘤及血行播散转移的影响及机制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 实验动物与试剂
        2.2 裸小鼠皮下荷瘤模型构建
            2.2.1 裸鼠饲养
            2.2.2 裸鼠皮下接种移植瘤
            2.2.3 皮下移植瘤生长情况观察
            2.2.4 qRT-PCR检测ARHI、p62mRNA在皮下移植瘤组织的表达水平
            2.2.5 免疫组化法检测移植瘤组织中相关蛋白表达
        2.3 裸小鼠血行播散转移模型构建
            2.3.1 肿瘤细胞尾静脉接种
            2.3.2 大体测量、取材、常规病理组织标本制备
            2.3.3 组织形态学观察
            2.3.4 肿瘤生长、转移相关生物标志物的检测分析
        2.4 统计学分析方法
    3 结果
        3.1 ARHI基因再表达对皮下移植瘤生长的影响及机制研究
            3.1.1 ARHI再表达显著抑制皮下移植瘤的生长
            3.1.2 ARHI再表达显著上调皮下移植瘤癌细胞的自噬水平
            3.1.3 ARHI再表达显著抑制皮下移植瘤癌细胞的增殖活性
            3.1.4 ARHI再表达明显抑制皮下移植瘤微血管生成
            3.1.5 ARHI再表达影响皮下移植瘤中p-AKT和α-Catenin的表达
            3.1.6 ARHI再表达显著上调皮下移植瘤癌细胞MIIP的表达
        3.2 ARHI再表达抑制血行播散胃癌细胞在肺、肝形成转移瘤的能力
    4 讨论
    5 结论
第三部分 胃癌组织中ARHI、LC3B、p62表达与临床病理因素和预后的关系及意义
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 临床病理资料
            2.1.1 临床标本收集
            2.2.2 临床病理资料
        2.2 免疫组织化学染色评价ARHI、p62、LC3B蛋白表达水平
            2.2.1 组织芯片的构建
            2.2.2 主要仪器
            2.2.3 免疫组织化学染色与结果判定
        2.3 统计学分析
    3 结果
        3.1 ARHI、p62、LC3B蛋白在正常胃粘膜和胃癌组织中的表达
        3.2 ARHI、p62、LC3B蛋白表达的的相关性
        3.3 ARHI、p62、LC3B蛋白表达与胃癌临床病理因素的相关性
        3.4 ARHI、p62、LC3B蛋白表达与患者预后的关系
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：3857881