UNC5B通过与CDC14A及P53结合介导膀胱癌细胞G2/M周期阻滞

发布时间：2023-12-02 19:28

　　目的:膀胱癌是发生在膀胱黏膜层的上皮性肿瘤。膀胱癌发病率较高,是我国最常见的泌尿系肿瘤。膀胱癌对传统的放疗化疗并不敏感,且由于膀胱癌细胞生物表型上的多样性,高病理分期的膀胱癌治疗效果及预后均不理想。新型分子靶向药物,通过激活抑癌基因或抑制癌基因的表达,降低膀胱癌的复发及远处转移。近年来,许多研究发现UNC5B是P53的直接靶基因,UNC5B可在缺少netrin-1结合或其自身过表达时,介导细胞凋亡并抑制细胞增殖。同时,UNC5B在多种肿瘤中具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭的生物学效应,并可增强化疗药对肿瘤的敏感性。本研究通过慢病毒转染、蛋白质谱分析和免疫沉淀实验鉴定UNC5B结合的相关结合蛋白,通过生物信息学分析其激活的分子通路及重要靶点,综合利用流式细胞技术、基因敲减技术及体内实验,深入探索UNC5B调控膀胱癌细胞周期、抑制肿瘤增殖的分子机制。方法:1.确定UNC5B在膀胱癌组织及膀胱癌细胞中的内源性表达。在中国医科大学附属第一医院泌尿外科的病理标本库中,选取20对经病理报告确认的膀胱癌与癌旁组织。应用PCR和WB法检测UNC5B在膀胱癌标本。用同样方法检测7种膀胱癌细胞器中UNC5...

【文章页数】：87 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文略缩语
第一部分:UNC5B通过调控细胞周期抑制膀胱癌细胞的增殖
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 临床资料及实验材料
            2.1.1 临床资料来源
        2.2 实验试剂所需要主要仪器,药品,试剂
            2.2.1 实验用膀胱癌细胞系
            2.2.2 实验仪器
            2.2.3 实验试剂
        2.3 试验方法
            2.3.1 免疫印迹（Western Blot）
            2.3.2 实时定量PCR
            2.3.3 细胞培养
            2.3.4 流式细胞仪测定细胞周期
            2.3.5 免疫荧光
            2.3.6 流式细胞仪测活细胞免疫荧光
            2.3.7 脂质体转染膀胱癌细胞
            2.3.8 慢病毒转染膀胱癌细胞
            2.3.9 诺考达唑同步化膀胱癌细胞周期及细胞周期检测
            2.3.10 RCTA法检测细胞增殖曲线
            2.3.11 UNC5B质粒胞内段的克隆构建
            2.3.12 统计学分析
    3 结果
        3.1 PCR显示UNC5B在膀胱癌中是抑癌因子
        3.2 PCR确定UNC5B在各细胞中的稳定转染
        3.3 Western Blot确定UNC5B的稳定转染
        3.4 荧光镜确定UNC5B在细胞中的转染
        3.5 流式细胞荧光技术确定UNC5B的转染
        3.6 UNC5B胞内段真核表达体的构建
        3.7 RCTA显示全长UNC5B抑制膀胱癌细胞增殖
        3.8 GO分析显示UNC5B抑制细胞增殖与周期调控相关
        3.9 全长UNC5B介导了膀胱癌细胞的G2/M周期阻滞
    4 讨论
    5 结论
第二部分: UNC5B通过结合CDC14A与 P53 磷酸化P53 介导G2/M周期阻滞
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验试剂所需要主要仪器,药品,试剂
            2.1.1 实验用膀胱癌细胞系
            2.1.2 实验仪器
            2.1.3 实验试剂
        2.2 试验方法
            2.2.1 免疫印迹(Western Blot)
            2.2.2 实时定量PCR
            2.2.3 免疫共沉淀(CO-IP)试验
            2.2.4 快速银染法鉴定差异蛋白
            2.2.5 蛋白质谱鉴定及生信分析
            2.2.6 异种移植瘤模型
            2.2.7 免疫组化
            2.2.8 统计学分析
    3 结果
        3.1 快速银染法检测组间的差异蛋白
        3.2 PPI分析显示了UNC5B介导周期阻滞的蛋白互作模式
        3.3 KEGG分析显示CDC14A是介导周期阻滞的关键蛋白
        3.4 TCGA数据库显示CDC14A与膀胱癌的相关性
        3.5 CO-IP证实CDC14A和 P53 可以结合UNC5B
        3.6 过表达UNC5B通过去磷酸化P53介导相关周期蛋白的改变
        3.7 动物实验证实UNC5B的体内抑癌效应
        3.8 免疫组化验证UNC5B的抑癌效应
    4 讨论
    5 结论
第三部分: 敲除CDC14A抑制UNC5B介导的周期阻滞并降低了UNC5B的体内抑癌效应.
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验试剂所需要主要仪器,药品,试剂
            2.1.1 实验用膀胱癌细胞系
            2.1.2 实验仪器
            2.1.3 实验试剂
        2.2 试验方法
            2.2.1 免疫印迹(Western Blot)
            2.2.2 实时定量PCR
            2.2.3 细胞培养
            2.2.4 脂质体转染膀胱癌细胞
            2.2.5 慢病毒转染膀胱癌细胞
            2.2.6 RCTA法检测细胞增殖曲线
            2.2.7 流式细胞仪测定细胞周期
            2.2.8 异种移植瘤模型
            2.2.9 免疫组化
            2.2.10 统计学分析
    3 结果
        3.1 CDC14A的成功敲减
        3.2 CDC14A的敲减抑制了UNC5B介导的G2/M周期阻滞效应
        3.3 CDC14A的敲减与细胞周期蛋白的表达相关
        3.4 CDC14A敲减回复了UNC5B在5637 细胞中的周期抑制效应
        3.5 CDC14A敲减回复了UNC5B在 T24 细胞中的周期抑制效应
        3.6 CDC14A的敲减降低了UNC5B的体内抑癌效应
        3.7 CDC14A的敲减增加了Ki67 的表达,降低了P53 的表达
        3.8 UNC5B通过CDC14A及 P53 介导周期阻滞的效应图
    4 讨论
    5 结论
本论文创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：3870188