利用重组凝集素筛选肿瘤相关蛋白及其功能研究

发布时间：2017-05-25 15:05

  本文关键词：利用重组凝集素筛选肿瘤相关蛋白及其功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肿瘤是威胁人类健康的重要疾病之一。攻克肿瘤这一难题是人类科学刻不容缓的事,随着分子生物学等学科领域水平的不断发展,发现肿瘤相关蛋白的种类和数量也不断的增多,它们在肿瘤细胞中的静态分布和动态移动过程,以及肿瘤细胞周期不同时期的变化。这些肿瘤相关蛋白可作为检测肿瘤发生及变化的标志物。无论是在生物学领域还是在医学领域,这些肿瘤相关蛋白在肿瘤的发生发展过程中就起到了非常明显的作用。凝集素作为一种糖结合蛋白能够结合到肿瘤细胞膜表面的糖分子。生物膜中含有一定量的糖类,主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素最大的特点在于它们能识别糖蛋白和糖肽,特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构,即细胞膜表面的碳脂化合物决定簇,一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力。因此,用凝集素可以筛选出肿瘤细胞表面的特异性糖蛋白。本课题利用鲈鱼凝集素(Dicentrarchus labrax lectin,DLL)、紫海胆凝集素(Strongylocentrotus purpuratus lectin,SPL)、盘鲍鱼唾液酸凝集素(Haliotis discus discus Lectin,HDDL)和人抑制性受体信号调节蛋白(inhibitory receptor signal regulator protein,SIRPα)构建了sCAR-DLL、sCAR-SPL、sCAR-HDDL、sCAR-SIRPα这四种融合蛋白作为筛选肿瘤相关蛋白的工具。融合蛋白的sCAR部分是腺病毒受体的膜外片段,能够和5型腺病毒结合;融合蛋白的凝集素部分可与肿瘤细胞膜上的某些糖蛋白结合,SIRPα是CD47的受体,在这里作为对照蛋白。因此,这些融合蛋白可以通过桥连作用,使腺病毒通过细胞膜糖蛋白特异感染凝集素识别的肿瘤细胞。实验中,将这些融合蛋白分别和携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒Ad-EGFP联合处理各种肿瘤细胞,通过荧光显微镜观察,以带绿色荧光细胞的比例显著增加作为凝集素识别肿瘤细胞的关键指标。首先,我们构建了sCAR-DLL、sCAR-SPL、sCAR-HDDL和sCAR-SIRPα这四种融合基因,并将其连接到原核表达载体pQE30上。待完成鉴定工作后,将质粒分别转到M15原核表达菌株中。通过IPTG诱导剂的诱导下,成功诱导出四种融合蛋白的表达,而且是以包涵体的形式表达。随后,我们又将大量诱导出的蛋白进行Ni离子亲和层析纯化及包涵体复性。经过鉴定,我们纯化出纯度较高的融合蛋白。随后我们又将这几种融合蛋白和Ad-EGFP共同作用于7721、A549、Hep3B、PLC和Hela细胞,发现融合蛋白sCAR-DLL对Ad-EGFP感染7721、A549、Hep3B和Hela细胞的作用都不明显;融合蛋白sCAR-SPL显著增强Ad-EGFP对A549和Hela细胞的感染效率,而对7721和Hep3B细胞的作用不明显;融合蛋白sCAR-HDDL对Ad-EGFP感染7721、A549、Hep3B和Hela细胞的作用也都不明显,但提高腺病毒对PLC细胞的感染效率.融合蛋白sCAR-SIRPα对Ad-EGFP感染各种肿瘤细胞的作用没有明显差异。综上所述,本课题构建了四种融合蛋白作为工具蛋白,并和Ad-EGFP联合作用感染多种肿瘤细胞,通过荧光显微镜观察Ad-EGFP对肿瘤细胞的感染效率。结果表明,融合蛋白对各种肿瘤细胞具有一定的识别特异性,提示凝集素DLL、SPL及HDDL能特异识别某些肿瘤细胞膜上的糖蛋白。以后将进一步鉴定各种凝集素所识别的糖蛋白,并对其功能进行研究。
【关键词】：凝集素 融合蛋白 免疫结合 肿瘤相关蛋白
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略语8-11
• 第一章 凝集素在肿瘤治疗领域的研究概况11-19
• 1.1 前言11-12
• 1.2 肿瘤研究状况12-13
• 1.3 凝集素的概况及在肿瘤研究中的应用13-18
• 1.3.1 凝集素是种类13-14
• 1.3.2 凝集素的结构特点及功能特点14-16
• 1.3.3 凝集素在肿瘤医学中的应用16-17
• 1.3.4 本研究中所用到的凝集素和所构建的融合蛋白17-18
• 1.4 本课题的来源及研究意义18-19
• 1.4.1 课题来源18
• 1.4.2 课题的意义18-19
• 第二章 实验器材19-24
• 2.1 生化试剂19-20
• 2.2 主要试剂配制20-22
• 2.3 实验仪器22
• 2.4 主要质粒、菌种22-23
• 2.5 引物设计与合成23-24
• 第三章 实验方法24-34
• 3.1 重组凝集素基因的构建24-30
• 3.1.1 DLL、SPL、HDDL、SIRP基因的获得24-28
• 3.1.2 原核表达载体的构建28-30
• 3.2 融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定30-34
• 3.2.1 融合蛋白的诱导表达及鉴定30
• 3.2.2 融合蛋白可溶性的鉴定30-31
• 3.2.3 融合蛋白的纯化及包涵体复性31-34
• 3.3 融合蛋白通过荧光显微镜筛选肿瘤相关蛋白34
• 第四章 实验结果34-51
• 4.1 原核表达载体构建34-39
• 4.1.1 sCAR-Linker凝胶电泳鉴定34-35
• 4.1.2 凝集素基因的凝胶电泳鉴定35-36
• 4.1.3 融合PCR凝胶电泳鉴定36-37
• 4.1.4 原核表达载体构建鉴定37-39
• 4.2 蛋白诱导表达及纯化39-46
• 4.2.1 融合蛋白的诱导表达及鉴定39-40
• 4.2.2 融合蛋白的可溶性与不可溶性鉴定40-41
• 4.2.3 融合蛋白纯化及包涵体复性41-46
• 4.3 融合蛋白筛选肿瘤相关蛋白46-51
• 4.3.1 荧光检测融合蛋白sCAR-DLL介导Ad-EGFP感染肿瘤细胞46-47
• 4.3.2 荧光检测融合蛋白sCAR-SPL介导Ad-EGFP感染肿瘤细胞47-48
• 4.3.3 荧光检测融合蛋白sCAR-HDDL介导Ad-EGFP感染肿瘤细胞48-49
• 4.3.4 荧光检测融合蛋白sCAR-SIRPα 介导Ad-EGFP感染肿瘤细胞49-51
• 讨论51-52
• 结论52-54
• 参考文献54-58
• 致谢58-59
• 硕士期间研究成果59

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本文编号：394096