潜在抑癌基因eIF4E3野生型和突变体质粒的构建

发布时间：2024-07-02 03:13

　　目的构建并鉴定野生型PIRES2-EGFP-eIF4E3(eIF4E3)、突变体PIRES2-EGFP-eIF4E3 C69a (e IF4E3C69a)、突变体PIRES2-EGFP-eIF4E3 w86a (e IF4E3 w86a)真核过表达载体,为进一步研究基因eIF4E3的功能奠定基础。方法通过PCR在人细胞cDNA库中扩增eIF4E3,人工化学合成突变体e IF4E3C69a和eIF4E3w86a。将目的片段和空载质粒PIRES2-EGFP分别双酶切后进行连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取单克隆,摇菌扩增,提取质粒,双酶切电泳、菌液及其质粒进行PCR鉴定、DNA测序鉴定。结果 PCR结果显示插入片段大小正确,测序结果通过Blast比对NIH基因库的eIF4E3基因序列显示e IF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3w86a序列准确且编码框架正确插入PIRES2-EGFP中。结论成功构建eIF4E3、eIF4E3C69a、e IF4E3W86a真核过表达载体。

【文章页数】：3 页

【部分图文】：

图1eIF4E3野生型和突变体基因PCR扩增电泳图

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，从扩增图可以看到3条大小约为675bp的条带，与预期的野生型（eIF4E3）和突变型（C69a、W86a）基因大小一致（图1）。2.2重组质粒PIRES2-EGFP-eIF4E3、PIRES2-EGFP-C69a、PIRES2-EGFP-W8....

图2eIF4E3野生型和突变体重组质粒双酶切鉴定图

经过琼脂糖凝胶电泳分析以后回收得到的PCR产物与PIRES2-EGFP空载体进行双酶切后，用连接酶进行连接用含有卡那霉素的LB培养基进行铺板长菌，挑取2～3个单克隆进行扩增并提取质粒最后进行双酶切及PCR鉴定。双酶切后可以得到大约675bp的片段（图2），进一步进行菌液及其质粒的....

图3eIF4E3野生型和突变体菌液及质粒PCR电泳图

图2eIF4E3野生型和突变体重组质粒双酶切鉴定图2.3重组质粒测序结果

图4eIF4E3野生型和突变体质粒测序图

eIF4E3是最近年新发现的一种潜在的抑癌基因。本实验中我们成功的将eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因链接到真核表达载体pIRES2-EGFP中。我们选用的pIRES2-EGFP真核表达载体容易进入细胞，容量比较大，易于检测，在临床实验中应用比较广泛....

本文编号：3999599