HER2特异性的嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤研究

发布时间：2017-06-08 18:21

  本文关键词：HER2特异性的嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：HER2阳性的乳腺癌恶性程度高、复发和转移发生早、预后差,对某些化疗药物有抵抗,并且HER2基因过度表达与患者较短的无病生存期和总生存期有密切关系。嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞是目前国际上最受关注的肿瘤细胞治疗技术之一,该技术通过在T细胞表面表达嵌合抗原受体,形成具有靶向性、克服肿瘤免疫逃逸能力、以及长久维持T细胞活性的新一代细胞治疗技术,在针对血液肿瘤的治疗中表现出了明显的治疗效果。然而,CAR-T细胞在治疗实体肿瘤时,由于潜在的脱靶毒性,使其安全性成为了其在实体瘤治疗应用上的重要瓶颈。国际上第一例CAR-T治疗死亡的案例就是为HER2阳性患者治疗时,引起正常肺组织表达的HER2受到CAR-T细胞攻击导致。因此,本研究旨在通过将CAR构建到NK-92MI细胞上,利用NK细胞不会产生白介素-6(IL-6)以及具有更短的体内存活时间的特点,来提高其安全性,为未来临床应用奠定基础。我们通过PCR以及常规分子克隆技术获得HER2-CAR片段,然后将其构建到慢病毒载体上,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染NK-92MI细胞,藉此比较用HER2分子的嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞(HER2-CAR-NK92MI)和未被基因修饰的NK-92MI细胞相比,能否提高对HER2阳性乳腺癌的杀伤效果。首先经病毒转染后,我们用流式检测HER2-CAR在NK-92MI细胞表面的表达情况,并检测HER2-CAR-NK92MI和未被基因修饰的NK-92MI细胞IFN-γ和颗粒酶的分泌差异,然后再用流式检测二者对乳腺癌细胞的体外杀伤效果,最后小鼠体内实验验证HER2-CAR-NK92MI细胞对乳腺癌原位肿瘤的杀伤作用。结果发现,HER2-CAR-NK92MI细胞对HER2阳性乳腺癌肿瘤细胞MCF-7,T47D的杀伤效率分别为62.4%和50.0%,而未被HER2-CAR基因修饰的NK-92MI细胞对其杀伤效率只有22.1%和16.9%;同时HER2-CAR-NK92MI细胞对HER2阴性的肿瘤细胞MDA-MB-468的杀伤效率为13.6%,未被HER2-CAR基因修饰的NK-92MI细胞对其杀伤效率为12.7%,进一步的SCID小鼠乳腺癌原位移植动物模型试验也证实HER2-CAR-NK92MI细胞具有更好的杀伤效率。由此可以得出结论,经HER2嵌合抗原体受体修饰的NK-92MI细胞可特异性识别HER2分子,对HER2阳性的乳腺癌肿瘤细胞的杀伤效率显著高于未被基因修饰的NK-92MI细胞。
【关键词】：NK-92MI细胞 HER2-CAR 乳腺癌细胞
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 引言9-13
• 材料和方法13-20
• 1 实验材料13-15
• 1.1 细胞系13
• 1.2 主要试剂和材料13
• 1.3 主要仪器与设备13-14
• 1.4 主要抗体14
• 1.5 主要试剂配方14-15
• 2 实验方法15-20
• 2.1 HER2-CAR-pCDH的构建15
• 2.2 慢病毒包装15-17
• 2.3 流式细胞术分析（Flow cytometry，FC）目的蛋白的表达17
• 2.4 细胞因子的检测17
• 2.5 体外细胞毒性实验17-18
• 2.6 小鼠肿瘤模型18-20
• 结果20-27
• 1.1 HER2-CAR-pCDH重组质粒构建20
• 1.2 慢病毒包装及滴度测定20-22
• 1.3 流式检测病毒转染22
• 1.4 HER2-/+细胞的筛选22-23
• 1.5 细胞毒性检测及统计学分析23-25
• 1.6 IFN-g和颗粒酶的检测25-26
• 1.7 小鼠肿瘤模型26-27
• 讨论27-30
• 参考文献30-35
• 综述 NK细胞在抗肿瘤免疫研究中的进展35-50
• NK细胞对肿瘤细胞的作用机制35-37
• 过继NK细胞免疫疗法37-38
• 不同细胞因子对NK细胞的影响38-39
• 嵌合抗原受体修饰NK细胞39-40
• NK细胞株的应用40-42
• 抗原特异性嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞对靶细胞的作用机制42
• 与其他药物结合治疗42-43
• 参考文献43-50
• 科研成果50-51
• 致谢51-53

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