AKT与XRCC1相互促进碱基切除修复在化疗药物耐受中的作用

发布时间：2017-06-13 12:17

  本文关键词：AKT与XRCC1相互促进碱基切除修复在化疗药物耐受中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的肿瘤细胞多药耐药性(MDR)是制约癌症治疗效果的主要因素之一。MDR发生与多种因素有关,包括细胞膜上ABC家族成员蛋白的增多、谷胱甘肽转移酶活性增强、拓扑异构酶基因的突变,以及DNA修复能力的增强等。尽管各种新的化疗药物和治疗方案不断产生并应用,但在大多数最常见的恶性肿瘤中却疗效甚微,其主要原因是肿瘤细胞在接受化疗药物治疗后不可避免的产生耐药反应。因此,研究肿瘤细胞多药耐受的形成机制对干预肿瘤的耐药反应及增强化疗药物的疗效具有重要意义。方法1为了研究肿瘤细胞耐药反应的形成机制,我们首先建立了阿霉素耐受的A549细胞系(A549/DOX)和5-氟尿嘧啶耐受的HCT-8细胞系(HCT-8/5-FU),这两种细胞株均表现出多药耐受。通过免疫印迹实验比较,比较药物敏感细胞株和耐药株中Akt信号通路的激活情况。2通过加入抑制剂的方法、免疫共沉淀实验和激光共聚焦实验,发现Akt和XRCC1之间的关系。3在药物敏感的A549和HCT-8细胞中,细胞瞬时转染XRCC1或其磷酸化突变体表达质粒。4利用Akt抑制剂和BER抑制剂联合化疗药物共处理耐药的肿瘤细胞,流式细胞术检测凋亡率。结论两种耐药细胞株中Akt信号通路均呈现异常激活,并且耐药细胞中碱基切除修复(base excision repair, BER)能力更强,化疗药物诱导的DNA损伤明显减少。因此,我们继续分析了Akt信号通路与BER之间的关系。作为活跃的DNA损伤修复途径,BER催化的底物范围广泛(如烷化剂、电离辐射以及铂类药物等形成的单功能DNA加合物等),因此BER修复功能增强与化疗药物耐药反应关系密切。BER是由多种蛋白、经多步骤完成的DNA修复反应。XRCC1是BER反应中不可或缺的核酸修复骨架蛋白。研究表明,XRCC1对Polβ、LIGⅢ及PARP有着稳定和调控的作用。XRCC1可以发生磷酸化翻译后修饰,且磷酸化水平与其蛋白水平有关。我们发现,与敏感细胞相比,耐药株中XRCC1蛋白水平及其磷酸化水平均明显增高,如果抑制Akt信号通路,则XRCC1和p-XRCC1的表达明显减少。为了进一步分析Akt和XRCC1的关系,我们通过免疫共沉淀实验和激光共聚焦实验发现,Akt与XRCC1具有相互作用。此外,在对药物敏感的A549和HCT-8细胞中过表达XRCC1或其磷酸化突变体能导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐受。最后,我们利用Akt抑制剂和BER抑制剂联合化疗药物共处理耐药的肿瘤细胞,由化疗药物诱导的细胞凋亡明显增加,说明Akt介导的BER在肿瘤细胞形成多药耐受中具有重要作用。结论综上所诉,本研究通过比较化疗药物敏感型和耐受型细胞中的差异,发现耐药细胞中Akt异常激活与BER修复能力增强直接相关,该作用是通过Akt与XRCC1的相互作用实现的,即：Akt与XRCC1结合,促进其磷酸化,增加其蛋白水平,进而增强了BER修复能力,削弱了化疗药物对细胞的杀伤性。本研究揭示了肿瘤细胞形成多药耐受的一种分子机制,该研究成果不仅为增强化疗药物疗效提供理论基础,也为临床克服肿瘤耐药提供参考。
【关键词】：Akt XRCC1 碱基切除修复 肿瘤耐药
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.53
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 第1章 绪论8-18
• 1.1 多药耐药性(Multiple drug resistance,MDR)8-10
• 1.1.1 MDR8
• 1.1.2 MDR产生机制8-9
• 1.1.3 克服肿瘤多药耐药的策略9-10
• 1.2 碱基切除修复(BER)10-14
• 1.2.1 DNA损伤修复机制10-11
• 1.2.2 BER简介及其过程11-12
• 1.2.3 BER的主要成员与MDR的关系12-14
• 1.3 Akt信号通路及其功能研究进展14-18
• 1.3.1 Akt信号通路14
• 1.3.2 Akt信号通路的功能14-16
• 1.3.3 Akt信号通路与多药耐药16-17
• 1.3.4 Akt信号在DNA修复中的作用17-18
• 第2章 Akt信号通路通过促进碱基切除修复调节细胞多药耐药性的分子机制研究18-43
• 2.1 实验材料与方法19-22
• 2.1.1 抗体与试剂19-20
• 2.1.2 表达质粒20
• 2.1.3 细胞培养与转染20
• 2.1.4 CCK-8测定细胞活力20
• 2.1.5 免疫印迹(Western blotting)与免疫共沉淀20-21
• 2.1.6 MMS敏感性实验21
• 2.1.7 细胞凋亡检测21-22
• 2.1.8 激光共聚焦实验22
• 2.1.9 统计学处理22
• 2.2 实验结果22-40
• 2.2.1 多药耐药细胞系的建立及其DNA损伤修复能力的检测22-26
• 2.2.2 Akt信号通路促进了碱基切除修复26-29
• 2.2.3 Akt通过与XRCC1相互作用促进了BER29-33
• 2.2.4 过表达XRCC1及其磷酸化突变体削弱了化疗药物的细胞毒性33-37
• 2.2.5 MK2206和ABT-888联用增加了化疗药物对耐药细胞的杀伤性37-40
• 2.3 分析与讨论40-43
• 附录43-53
• 附录A 实验步骤43-46
• 附录B 实验用主要溶液、实验仪器46-51
• 附录C 实验用主要溶液、实验仪器51-53
• 参考文献53-59
• 在读期间发表的学术论文及研究成果59-60
• 致谢60

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本文编号：446506