S100A9过表达在急性髓细胞性白血病细胞株HL-60对化疗药物耐药作用中的研究

发布时间：2017-06-21 01:04

  本文关键词：S100A9过表达在急性髓细胞性白血病细胞株HL-60对化疗药物耐药作用中的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分S100A9慢病毒载体的构建以及慢病毒的包装目的:构建S100A9慢病毒载体并包装慢病毒颗粒,为该基因在AML对化疗药物耐药作用中的研究奠定基础。方法:以正常人BMMC c DNA为模板,克隆出S100A9全长c DNA并装载入p MD19-T载体中后,挑选出阳性克隆进行PCR、双酶切和测序鉴定。将测序正确的阳性克隆中的S100A9片段装载入目的载体p LVX-IRES-puro中,筛选阳性克隆后进行PCR、双酶切及测序鉴定。利用磷酸钙沉淀法,将过表达载体与病毒包装质粒共同转染293T细胞,分别收集24 h和48 h的病毒上清。收集转染后48 h的293T细胞,western blot检测细胞中S100A9的蛋白表达。结果:克隆出的S100A9片段与p MD19-T载体连接后的阳性克隆,经PCR和双酶切验证条带大小与目的条带大小几乎一致。挑选其中的五个克隆进行测序,结果显示插入片段的序列与NCBI数据库中S100A9的m RNA序列100%匹配。将测序正确的克隆中的片段插入目的载体p LVX-IRES-puro中,阳性菌落经PCR、双酶切和测序验证均与欲克隆的S100A9片段大小和序列100%匹配。收集转染后48 h的293T细胞检测发现:与转染了空载体细胞中S100A9的蛋白含量相比,转染了过表达载体细胞中S100A9的蛋白表达量显著增加。结论:成功构建S100A9慢病毒载体,并且包装出慢病毒颗粒。第二部分S100A9过表达可以引起急性髓细胞性白血病细胞株HL-60的选择性耐药目的:研究S100A9过表达是否可以引起AML细胞株HL-60对临床常规化疗药物(柔红霉素、依托泊苷、阿糖胞苷以及高三尖杉酯碱)的耐药。方法:利用慢病毒颗粒感染细胞并用嘌呤霉素药物筛选的方式,建立S100A9稳定过表达AML细胞株HL-60/S100A9,以及空载体HL-60/p LVX对照细胞株。四种临床常规化疗药物柔红霉素、依托泊苷、阿糖胞苷以及高三尖杉酯碱以依次递增的浓度分别处理这两组细胞24 h后,使用CCK 8检测细胞活性。对照细胞的四种化疗药物的IC50分别处理两组细胞24 h后,使用凋亡试剂盒检测细胞凋亡。以IC25和IC50分别处理两组细胞后,使用western blot检测药物处理前后细胞中c-PARP的蛋白表达量。结果:外源性S100A9整合进入HL-60细胞的基因组DNA中,同时HL-60/S100A9细胞中S100A9在m RNA和蛋白水平都显著增高。HL-60/S100A9细胞经过柔红霉素、依托泊苷和阿糖胞苷三种化疗药物处理后,细胞活性未受影响;但是高三尖杉酯碱显著抑制了细胞活性,与对照细胞相比没有统计学差异。柔红霉素、依托泊苷和阿糖胞苷药物处理两组细胞后,HL-60/S100A9组的凋亡细胞比率显著低于HL-60/p LVX组;然而高三尖杉酯碱处理后,两组凋亡细胞比例没有统计学差异。同样,HL-60/S100A9细胞中c-PARP蛋白在前三种药物处理后没有显著的改变;但是在高三尖杉酯碱处理后,蛋白表达呈现正向剂量依赖性。结论:S100A9的高表达可以引起AML细胞株HL-60对临床常规化疗药物柔红霉素、依托泊苷和阿糖胞苷的显著耐药,从而预示AML疾病对治疗效果反应不良。S100A9过表达的AML细胞株HL-60对高三尖杉酯碱敏感。第三部分S100A9过表达急性髓细胞性白血病细胞株HL-60对Mcl-1抑制剂敏感目的:进一步研究S100A9引起AML细胞株HL-60对临床常规化疗药物耐药的分子机制,并探索解决S100A9引发化疗药物耐药的途径。方法:对HL-60/p LVX和HL-60/S100A9两组细胞分别进行RNA-Seq测序。对测序分析挑选出的候选基因进行蛋白水平的验证。使用Mcl-1小分子抑制剂YM-155处理细胞后,分别用MTT法检测细胞的活性以及western blot检测药物处理前后Mcl-1的蛋白表达。结果:RNA-Seq结果显示,S100A9和Mcl-1的表达量在HL-60/S100A9中显著增高。以HL-60/p LVX为对照细胞,抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2在HL-60/S100A9中表达量显著增高。经过四种化疗药物(DNR、VP-16、Ara-C和HHT)处理后,Bcl-2的蛋白表达量在两组细胞中均未发生改变。经过DNR、VP-16和Ara-C三种药物处理后,Mcl-1的蛋白表达量在两组细胞中也未发生改变;然而经过HHT处理后,Mcl-1的表达量在两组细胞中均显著降低。Mcl-1小分子抑制剂YM-155分别处理两组细胞后,细胞活性均受到抑制。并且,Mcl-1的蛋白表达量在两组细胞中也随着药物处理浓度的增加而显著降低。结论:S100A9过表达可以引起抗凋亡蛋白Mcl-1的表达量显著上调;并且使用Mcl-1抑制剂YM-155有望克服S100A9过表达引起的AML细胞株HL-60对化疗药物耐药性。
【关键词】：S100A9 慢病毒 p LVX 293T细胞 S100A9 HL-60 化疗药物 耐药 S100A9 Mcl-1 化疗药物 YM-155
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 第一部分 S100A9慢病毒载体的构建以及慢病毒的包装12-24
• 引言12-13
• 材料与方法13-19
• 一、材料13-16
• 二、方法16-19
• 结果19-22
• 讨论22
• 结论22
• 参考文献22-24
• 第二部分 S100A9过表达可以引起急性髓细胞性白血病细胞株HL-60 的选择性耐药24-44
• 引言24-25
• 材料与方法25-34
• 一、材料25-30
• 二、方法30-34
• 结果34-38
• 讨论38-40
• 结论40
• 参考文献40-44
• 第三部分 S100A9过表达急性髓细胞性白血病细胞株HL-60 对Mcl-1 抑制剂敏感44-55
• 引言44-45
• 材料与方法45-47
• 一、材料45-46
• 二、方法46-47
• 结果47-49
• 讨论49-51
• 结论51
• 参考文献51-55
• 综述 S100A9作为药物靶点在肿瘤疾病中的研究55-68
• 参考文献62-68
• 英汉双解缩列词表68-69
• 攻读学位期间发表的论文69-70
• 致谢70-71

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本文编号：467276