BMP4对肝癌VM形成影响的研究

发布时间：2017-06-21 20:18

  本文关键词：BMP4对肝癌VM形成影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【研究目的】肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是一种管壁由肿瘤细胞围成的、不依赖机体内皮细胞的肿瘤微循环模式。VM与肿瘤的浸润和转移、临床分期、不良预后有关。BMP4是TGF-β超家族中的一员,研究发现BMP4在促进肿瘤细胞迁移侵袭过程中发挥重要作用。本研究通过探讨BMP4在肝癌VM形成中发挥的作用,期待能为肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的治疗提供新的的思路和靶点。【研究方法】1、收集天津医科大学总医院和肿瘤医院经手术切除且随访资料完整并经病理诊断为肝细胞肝癌的病例标本92例,利用免疫组化方法,将病例分为BMP4阳性组和BMP4阴性组,分析BMP4与VM、年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、临床分期、转移之间的关系;用Kaplan-Meier生存分析比较BMP4阳性组与BMP4阴性组患者的生存预后情况。2、根据BMP4的表达水平,选取低表达BMP4的HCC细胞系HepG2细胞和高表达BMP4的HCC细胞系SMMC7721细胞。HepG2细胞转染BMP4上调质粒构建BMP4上调模型,SMMC7721细胞转染BMP4下调质粒构建BMP4下调模型。利用Western Blot及细胞免疫荧光鉴定BMP4转染效果。3、利用划痕和侵袭实验评价上调BMP4对HepG2细胞迁移侵袭能力变化;下调BMP4对SMMC7721细胞迁移侵袭能力变化。4、利用三维培养分析上调BMP4对HepG2细胞管状结构形成能力的影响;下调BMP4对SMMC7721细胞管状结构形成能力的影响。5、利用Western Blot及细胞免疫荧光实验检测上调BMP4对HepG2细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)、干细胞相关分子(OCT4、SOX2)表达的影响;下调BMP4对SMMC7721细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)、干细胞相关分子(OCT4、SOX2)表达的影响。6、利用Western Blot及细胞免疫荧光实验检测上调BMP4对HepG2细胞VM相关蛋白EphA2、VE-cadherin及MMP2表达的影响;下调BMP4对SMMC7721细胞VM相关蛋白EphA2、VE-cadherin及MMP2表达的影响。7、利用明胶酶谱实验检测上调BMP4对HepG2细胞中MMP2表达活性的影响;下调bmp4对smmc7721细胞中mmp2表达活性的影响。【研究结果】1、免疫组化染色结果显示,在92例肝癌标本中,52例呈bmp4阳性表达,40例呈bmp4阴性表达。分析bmp4阳性组和bmp4阴性组与肝癌患者临床病理资料的关系显示,bmp4与vm呈正相关(χ2=5.662,p=0.017)。bmp4在年龄45岁的患者中表达较高,而在≤45岁的患者中表达较低(χ2=8.400,p=0.004)。bmp4在不同病理分级的患者中表达不同,bmp4在低分化(Ⅲ~Ⅳ)的患者中表达高于高分化(Ⅰ~Ⅱ)的患者(χ2=4.048,p=0.044)。bmp4在不同临床分期的患者中表达也不同,在Ⅲ~Ⅳ期的患者中的表达较Ⅰ~Ⅱ期的患者表达高(χ2=5.475,p=0.019)。bmp4在不同性别、肿瘤大小、有无转移的患者中的差异无统计学意义(p0.05)。kaplan-meier生存分析结果显示,bmp4阳性组较bmp4阴性组患者的生存时间短(p=0.046)。2、westernblot及细胞免疫荧光实验显示转染bmp4上调质粒后hepg2细胞bmp4表达明显上调,转染bmp4下调质粒后smmc7721细胞bmp4表达明显下调。3、划痕和侵袭实验结果显示,上调bmp4后,hepg2细胞迁移侵袭能力明显提高(p0.05);下调bmp4后,smmc7721细胞迁移侵袭能力明显降低(p0.05)。4、三维培养结果显示,上调bmp4后,hepg2细胞形成管状结构的能力明显增强;下调bmp4后,smmc7721细胞形成管状结构的能力明显降低。5、westernblot及细胞免疫荧光实验结果显示,上调bmp4后,hepg2细胞中emt相关蛋白vimentin表达增强,e-cadherin表达降低,干细胞相关分子oct4、sox2表达增强;下调bmp4后,smmc7721细胞中emt相关蛋白vimentin表达降低,e-cadherin表达增强,干细胞相关分子oct4、sox2表达降低。6、westernblot及细胞免疫荧光实验结果显示,上调bmp4后,hepg2细胞vm相关蛋白epha2、ve-cadherin、mmp2表达增强;下调bmp4后,smmc7721细胞vm相关蛋白epha2、ve-cadherin、mmp2表达降低。7、明胶酶谱实验检结果显示,上调bmp4后,hepg2细胞mmp2表达活性增强;下调bmp4后,smmc7721细胞mmp2表达活性降低。【研究结论】1、BMP4与肝癌的VM、年龄、病理分级、临床分期呈正相关,与其它临床病理资料无关,并且BMP4表达阳性的患者生存时间短,预后不良。2、BMP4可以增强HCC细胞的迁移、侵袭能力和VM形成能力,它可能是通过诱导HCC细胞发生EMT、获得某些干性特点及EphA2/VE-cadherin/MMP2通路来促进肝癌VM形成。本研究可能为肝癌的抗血管治疗提供了新的作用靶点。
【关键词】：BMP4 肝细胞肝癌 血管生成拟态 上皮—间充质转化 干性
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语12-13
• 前言13-17
• 研究现状、成果13-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、人肝癌组织中BMP4与VM及临床病理资料之间的的关系17-25
• 1.1 对象和方法17-19
• 1.1.1 病理资料17
• 1.1.2 免疫组化染色17
• 1.1.3 实验方法17-19
• 1.1.4 免疫组化结果判定19
• 1.1.5 统计学分析19
• 1.2 结果19-23
• 1.2.1 肝癌患者临床病理资料特征19
• 1.2.2 肝癌中VM的 形态学观察19-21
• 1.2.3 肝癌中BMP4与VM，临床病理参数的关系21-23
• 1.3 小结23-25
• 二、BMP4对肝癌细胞体外形成VM的影响25-44
• 2.1 对象和方法25-34
• 2.1.1 实验材料25-29
• 2.1.2 研究方法29-34
• 2.1.3 统计学分析34
• 2.2 结果34-43
• 2.2.1 BMP4在HCC细胞系中的表达情况，在HepG2细胞中建立BMP4上调模型，在SMMC7721细胞中建立BMP4下调模型34-36
• 2.2.2 BMP4表达上调使HCC细胞的迁移侵袭能力增加，BMP4表达下调使HCC细胞的迁移侵袭能力降低36-38
• 2.2.3 BMP4表达上调促进体外HCC细胞VM形成，BMP4表达下调抑制HCC细胞VM形成38-39
• 2.2.4 上调BMP4诱导EMT的发生及干细胞标记物OCT4、SOX2的表达，， 下调BMP4抑制EMT的发生及OCT4、SOX2的表达39-40
• 2.2.5 BMP4通过EphA2/VE-cadherin/MMP2通路促进HCC VM形成40-43
• 2.3 小结43-44
• 讨论44-49
• 结论49-50
• 参考文献50-59
• 发表论文和参加科研情况说明59-60
• 综述60-69
• 综述参考文献66-69
• 致谢69

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