通过调控ROS建立人乳腺癌多药耐药细胞株及其机制研究

发布时间：2017-06-22 18:06

  本文关键词：通过调控ROS建立人乳腺癌多药耐药细胞株及其机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过调控ROS建立人乳腺癌多药耐药细胞株并研究其机制。方法:通过DCFH-DA染色、激光共聚焦显微镜观察MCF-7及其耐药株MCF-7/ADM细胞内荧光强度及分布,流式细胞仪检测MCF-7及其耐药株MCF-7/ADM细胞内ROS含量差异。使用不同浓度H2O2、GSH作用不同时间,MTT法检测阿霉素(ADM)对MCF-7细胞的抑制作用,根据实验结果选定H2O2的造模浓度为0.001,0.01,0.1μmol/L,造模时间为20周,耐药性最高者命名为MCF-7/ROS细胞;选定GSH的造模浓度为0.001,0.01,0.1 mmol/L,造模时间为12周,耐药性最高者命名为MCF-7/GSH细胞。采用MTT法测定各浓度阿霉素、紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、氨鲁米特、环磷酰胺对MCF-7/ROS细胞的抑制率,计算IC50及耐药指数;SRB法检测各浓度紫杉醇对MCF-7/GSH细胞的抑制率,计算IC50及耐药指数。倒置显微镜下观察所建耐药细胞株的形态学变化。运用PI单染法、流式细胞术检测MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ROS、MCF-7/GSH细胞的周期分布。采用流式细胞术检测所建耐药细胞内ROS的含量变化;高内涵细胞术观察ROS在MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ROS细胞内的分布情况。采用Western blot法检测各组细胞MRP1和P-gp表达的剂量依赖性及时间依赖性关系;激光共聚焦显微镜观察MCF-7,MCF-7/ROS细胞中MRP1和P-gp的表达及分布。流式细胞术检测所建耐药细胞对Rh123的累积能力。化学法检测MCF-7/ROS和MCF-7/GSH细胞内GPx和GSH的含量、SOD和Catalase的活性变化。通过使用工具药Y294002、PD98059、PDTC和Staurosporine,MTT法检测MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ROS和MCF-7/GSH细胞对ADM耐药性的变化;Western blot法检测细胞内p-Akt、p-ERK、p-I-?B、PKCα、P-gp、MRP1、GSTπ的表达,分析MCF-7/ROS和MCF-7/GSH细胞耐药产生的机制。采用激光共聚焦显微镜检测MCF-7及MCF-7/ROS细胞中耐药相关的核转录因子Nrf2,NF-κB,HIF-1α的表达与分布。结果:耐药细胞MCF-7/ADM内ROS含量约为敏感株细胞的2.77±0.21倍,且呈均匀分布。长期孵育H2O2及GSH均可诱导MCF-7细胞产生多药耐药,且在一定范围内呈剂量依赖性。其中0.1μmol/L的H2O2连续孵育20周及0.1 mmol/L的GSH连续孵育12周所诱导产生的耐药性最强;分别命名为MCF-7/ROS和MCF-7/GSH细胞。此后随孵育时间延长,细胞耐药性未出现显著性改变。MCF-7/ROS细胞对阿霉素、紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、氨鲁米特、环磷酰胺的耐药指数分别为13.99、4.61、5.32、1.73、8.80、4.06、3.49,MCF-7/GSH细胞对紫杉醇的耐药指数为3.29。与MCF-7相比,MCF-7/ADM、MCF-7/ROS、MCF-7/GSH耐药细胞的G2/M期所占比例有显著增加,而MCF-7/GSH细胞S期所占比例则相对减少。流式细胞术及高内涵细胞术检测结果表明长期孵育H2O2及GSH均可降低MCF-7细胞内的ROS含量。Western blot和激光共聚焦显微镜检测结果表明,长期调控ROS可剂量、时间依赖性诱导MCF-7细胞表达MRP1和P-gp,且该外排蛋白主要分布于细胞膜上;此外,各模型组细胞对Rh123的累积能力均显著降低。与MCF-7相比,MCF-7/ROS与MCF-7/ADM耐药细胞内GPx和GSH含量均高于敏感株,但SOD和Catalase活性与敏感株相比无显著差异;MCF-7/GSH细胞则表现为GPx含量降低,而GSH含量与SOD、Catalase活性均有显著升高。机制研究表明:PI3K、ERK、NF-κB和PKC的抑制剂均可不同程度地逆转MCF-7/ADM、MCF-7/ROS和MCF-7/GSH细胞的耐药性。其中,对于MCF-7/ROS细胞,LY294002、PD98059均可显著下调MRP1、P-gp的表达;LY294002可显著下调GSTπ的表达。对于MCF-7/GSH细胞,LY294002、PDTC、PD98059可显著下调MRP1的表达;LY294002、PDTC可显著下调P-gp的表达;LY294002、Staurosporine可显著下调GSTπ的表达。此外,MCF-7/ROS细胞中Nrf2,NF-κB,HIF-1α的表达均显著高于其敏感株MCF-7细胞,其中过量表达的Nrf2与HIF-1α均于核内聚集。结论:耐药株MCF-7/ADM细胞内ROS的含量显著高于其敏感株MCF-7细胞。通过双向调控ROS,对敏感MCF-7细胞长期孵育低剂量的H2O2和GSH,可分别建立MCF-7/ROS和MCF-7/GSH耐药细胞模型,且该模型细胞均具有肿瘤多药耐药的特点。所建耐药细胞特征主要体现为:细胞周期的变化、细胞内ROS含量的变化、外排蛋白功能与表达的变化、细胞内抗氧化系统的变化等。耐药机制可能涉及PI3K、ERK、NF-κB和PKC信号通路,最终通过上调细胞内MRP1、P-gp和GSTπ的功能与表达介导肿瘤多药耐药的产生。此外,在MCF-7/ROS细胞中,ROS或可通过激活Nrf2,HIF-1α等核转录因子介导多药耐药。
【关键词】：MDR ROS MCF-7 P-gp MRP1 信号通路
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 前言12-16
• 参考文献13-16
• 第一章 通过调控ROS建立人乳腺癌耐药细胞株16-30
• 1 实验材料17-19
• 1.1 药品与试剂17-18
• 1.2 主要仪器18-19
• 2 实验方法19-22
• 2.1 MCF-7 和MCF-7/ADM细胞的培养19
• 2.2 检测人乳腺癌细胞MCF-7 及MCF-7/ADM中ROS含量19-20
• 2.3 MCF-7/ROS的建立及耐药性检测20-21
• 2.4 MCF-7/GSH的建立及耐药性检测21-22
• 3 统计学处理22
• 4 结果22-27
• 4.1 人乳腺癌细胞MCF-7 及MCF-7/ADM中ROS含量差异22-23
• 4.2 MCF-7/ROS的建立及耐药性评价23-24
• 4.3 MCF-7/GSH的建立及耐药性评价24-27
• 5 讨论27-29
• 6 小结29
• 参考文献29-30
• 第二章 通过调控ROS诱导产生耐药的细胞特征研究30-54
• 1 实验材料33-35
• 1.1 药品与试剂33-35
• 1.2 主要仪器35
• 2 实验方法35-41
• 2.1 MTT法检测细胞耐药倍数35-36
• 2.2 倒置显微镜观察细胞形态学变化36
• 2.3 流式细胞仪检测细胞周期36
• 2.4 流式细胞仪和高内涵细胞术检测细胞内ROS含量与分布36-37
• 2.5 Western Blot法测定各组细胞内MRP1、P-gp的表达37-39
• 2.6 激光共聚焦显微镜观察细胞内MRP1、P-gp的表达与分布39
• 2.7 流式细胞术检测细胞内Rh123的累积39-40
• 2.8 化学法检测细胞内抗氧化系统的特点40-41
• 3 统计学处理41
• 4 结果41-48
• 4.1 MCF-7/ROS、MCF-7/GSH细胞具有多药耐药性41-42
• 4.2 所建耐药细胞的形态学特点42
• 4.3 所建耐药细胞的周期变化特点42-43
• 4.4 所建耐药细胞内ROS含量与分布的特点43-45
• 4.5 各组细胞内MRP1、P-gp的表达情况45
• 4.6 细胞内MRP1、P-gp的表达与分布情况45-47
• 4.7 各组细胞耐药蛋白的外排功能47
• 4.8 所建耐药细胞的抗氧化系统特点47-48
• 5 讨论48-50
• 6 小结50-51
• 参考文献51-54
• 第三章 ROS诱导多药耐药的机制研究54-74
• 1 实验材料56-58
• 1.1 药品与试剂56-58
• 1.2 主要仪器58
• 2 实验方法58-61
• 2.1 MTT法检测通路抑制剂对细胞耐药性的影响58-59
• 2.2 Western blot法检测细胞内耐药相关蛋白的表达59-61
• 2.3 激光共聚焦显微镜观察细胞内核转录因子的表达及分布61
• 3 统计学处理61
• 4 实验结果61-66
• 4.1 抑制剂可不同程度地逆转细胞的耐药性61-62
• 4.2 耐药细胞内相关通路的蛋白表达62-64
• 4.3 MCF-7/ROS细胞内核转录因子的表达与分布64-66
• 5 讨论66-67
• 6 小结67-68
• 参考文献68-74
• 第四章 综述 通过调控ROS治疗耐药肿瘤的研究进展74-90
• 参考文献82-90
• 英文缩略词表（Abbreviations and acronyms）90-92
• 致谢92-93
• 攻读硕士期间发表论文93-94

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本文编号：472623