人食管鳞癌癌前病变基因及相关蛋白表达变化的研究

发布时间：2017-06-23 02:04

  本文关键词：人食管鳞癌癌前病变基因及相关蛋白表达变化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：食管癌是由食管的鳞状上皮或腺状上皮异常增生发展而来。食管癌的发生由多因素、多基因共同参与经过多个阶段(轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生以及浸润癌)慢慢演化而来。在病理上食管癌主要分为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌,而我国食管鳞癌患者的发病率和死亡率居世界首位。目前随着分子生物学发展,食管鳞癌发生的分子机制备受关注。在本文第一部分的研究中,我们应用表达谱芯片技术对10例ESCC组织、7例癌前病变组织及29例切缘及远端正常组织的基因表达谱进行分析,得到ESCC及癌前病变组织中差异性表达基因333个,从中筛选出候选基因9个,并对其中的极光激酶基因(Aurora kinases A, Aurora-A)进行研究。Aurora-A是一个潜在的癌基因,通过编码一种在进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,来参与调控细胞的有丝分裂过程和维持染色体组的完整性。我室于2004年首次发现了Aurora-A与ESCC相关,并做了大量地研究工作,但Aurora-A在ESCC癌前病变阶段的表达情况和作用方式尚未明确。首先,我们应用Real-time PCR实验验证了上述表达谱芯片结果,Aurora-A基因在6例癌前病变组织和3例ESCC组织中的表达程度高于其自身远端正常组织,高表达的比率分别为75.0%(6/8)和60.0%(3/5)。与人食管上皮永生化细胞株相比,Aurora-A在ESCC细胞株中的表达水平明显升高。说明Aurora-A在ESCC及其癌前病变中存在高表达现象。然后,我们应用组织芯片技术和免疫组织化学法(S-P法)检测Aurora-A在9例重度不典型增生组织和122例ESCC组织以及它们的癌旁癌前病变组织中的表达情况,结果发现Aurora-A在正常食管粘膜上皮组织、轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生以及ESCC组织中的阳性率分别为17.2%、27.6%、50.0%、77.9%和84.3%,其表达率随病变严重程度而逐渐增加。Aurora-A蛋白表达水平与ESCC癌前病变严重程度呈正相关(r=0.548,P0.001)。最后,通过体外实验证实外源性过表达Aurora-A对人食管上皮永生化细胞的增殖能力以及迁移能力均有促进作用。所以我们的研究表明,Aurora-A在ESCC及其癌前病变中存在高表达,可能参与食管癌的发生与发展,并且可能为ESCC的早期诊断及治疗提供新的方向。本文第二部分研究ESCC及其癌前病变组织中Ninein样蛋白(ninein like protein,Nlp)的表达情况。Nlp是我室通过酵母双杂交实验筛选出来的能够自行定位克隆的中心体蛋白,在多种肿瘤中存在表达,多项前期研究结果提示Nlp是一个潜在的癌基因。我们应用免疫组织化学法联合组织微阵列,检测Nlp在10例重度不典型增生组织和133例ESCC组织以及它们的癌旁癌前病变组织中的表达情况,Nlp在正常食管粘膜上皮组织、轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生及ESCC组织中的阳性率分别为11.0%、27.8%、50.0%、80.0%和94.1%,其表达率随病变严重程度而逐渐增加。Nlp蛋白表达水平与ESCC癌前病变严重程度呈正相关(r=0.526,P0.001)。说明Nlp基因可能参与ESCC及其癌前病变的发生与发展。另外,体外实验证实外源性过表达Nlp会促进人食管上皮永生化细胞的迁移能力。所以,第二部分研究明确表明Nlp在ESCC及其癌前病变中存在高表达,并且可能在ESCC癌前病变发生和发展中起一定的作用。
【关键词】：表达谱芯片 食管癌 癌前病变 Aurora-A Nlp
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 中英文缩略词7-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一部分12-65
• 前言13-16
• 材料与方法16-41
• 1. 实验材料16-24
• 1.1 组织样本16
• 1.2 菌种、质粒及细胞株16-17
• 1.3 主要试剂17-19
• 1.4 主要仪器设备19-21
• 1.5 实时定量PCR引物序列21
• 1.6 重要试剂的配制21-24
• 2. 研究方法24-41
• 2.1 细胞处理24-25
• 2.2 总RNA和总蛋白的提取25-27
• 2.3 RNA和蛋白浓度测定27-28
• 2.4 利用基因芯片检测mRNA表达谱28-33
• 2.5 PCR33-34
• 2.6 Western Blotting34-35
• 2.7 感受态细胞的制备35-36
• 2.8 转化36
• 2.9 质粒提取及鉴定36-38
• 2.10 质粒瞬时转染38-39
• 2.11 Transwell实验39
• 2.12 免疫组织化学39-40
• 2.13 统计学分析40-41
• 实验结果41-59
• 1. ESCC组织中差异性表达的基因41-44
• 1.1 利用表达谱芯片检测ESCC组织样本中总mRNA表达谱42-43
• 1.2 ESCC组织mRNA表达的总体特征43
• 1.3 ESCC组织中差异性表达基因的功能分析43-44
• 2. 重度不典型增生组织中差异性表达的基因44-48
• 2.1 重度不典型增生组织mRNA表达的总体特征46-47
• 2.2 在正常组织、切缘组织及病变组织中逐渐高表达的基因47
• 2.3 在正常组织、切缘组织及病变组织中逐渐降低表达的基因47-48
• 3. 在ESCC及重度不典型增生组织中均出现差异性表达的基因48-49
• 4. 差异性表达的候选基因49-53
• 4.1 候选基因在临床组织中mRNA水平的表达情况49-51
• 4.2 候选基因在各细胞株中的表达情况51-53
• 5. 候选基因Aurora-A53-59
• 5.1 候选基因Aurora-A在ESCC及其癌前病变组织中的表达特征54-57
• 5.2 过表达Aurora-A基因,人食管上皮永生化细胞体外增殖和迁移能力均上升57-59
• 讨论59-63
• 展望63-64
• 小结64-65
• 第二部分65-82
• 前言66-68
• 材料与方法68-73
• 1. 实验材料68-69
• 1.1 组织样本68
• 1.2 菌种、质粒及细胞株68
• 1.3 主要试剂68
• 1.4 主要仪器设备68-69
• 1.5 引物的合成与设计69
• 1.6 重要试剂的配制69
• 2. 研究方法69-73
• 2.1 对细胞的处理69
• 2.2 细胞总RNA和总蛋白的提取69-70
• 2.3 RNA和蛋白的浓度测定70
• 2.4 P C R70
• 2.5 Western Blotting70
• 2.6 Transwell实验70-71
• 2.7 免疫组织化学71-72
• 2.8 数据的获取及分析72-73
• 实验结果73-78
• 1. Nlp基因在ESCC及其癌前病变组织中的表达特征73-75
• 1.1 Nlp的表达水平与食管上皮鳞状细胞的病变严重程度呈正相关73-74
• 1.2 Nlp的表达水平与其他主要临床特征无明显相关性74-75
• 2. Nlp基因和Aurora-A基因的表达水平呈线性正相关75-76
• 3. Nlp基因mRNA在临床组织中的表达情况76-77
• 4. 过表达Nlp基因,人食管上皮永生化细胞迁移能力显著上升、体外增殖能力也存在上升现象77-78
• 讨论78-81
• 小结81-82
• 参考文献82-87
• 文献综述87-93
• 参考文献90-93
• 致谢93-94
• 硕士在读期间发表与待发表论文94-95
• 基金资助95-96

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 封冰;陈龙邦;;微小RNA与表观遗传调控:肿瘤治疗新策略[J];医学研究生学报;2011年01期

2 廖乃凯;俞建军;;趋化素样因子研究进展及其与前列腺癌的关系[J];现代泌尿外科杂志;2011年04期

3 何洪智;赵晓航;张立勇;吴e，

本文编号：473645