TAMs对食管癌相关淋巴管内皮细胞增殖和迁移能力的影响

发布时间：2017-06-23 23:05

  本文关键词：TAMs对食管癌相关淋巴管内皮细胞增殖和迁移能力的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的食管癌是消化系统比较常见的恶性肿瘤之一,对人类的生命与健康产生极大的危害。我国食管癌的发病率高居于世界首位,80%的患者发病年龄在50岁以后,男性高于女性。近几年来食管癌的发病年龄逐渐趋于年轻化。在我国食管癌的发病地区具有明显的地域性,特别是在太行山脉附近的省份发病率明显偏高。由于早期食管癌临床症状并不明显,患者多在出现吞咽困难、咽下疼痛时才就诊,确诊时往往已经到了中晚期,且多发生了淋巴道转移,治疗效果欠佳。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)是肿瘤组织中作用最强及数量最多的炎性细胞。目前根据巨噬细胞的活化状态和在机体中发挥功能的不同,巨噬细胞主要分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞可杀灭肿瘤细胞并抑制肿瘤淋巴管及血管形成,而M2型巨噬细胞主要促进肿瘤淋巴管及血管生成。已知的促进淋巴管生成的主要调控因子是血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C),其可与淋巴管内皮细胞表面的特异性受体血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)结合,诱导其发生酪氨酸激酶磷酸化,从而促进肿瘤周围新的淋巴管生成,为肿瘤淋巴道的转移提供了通道。除了肿瘤细胞可分泌VEGF-C,肿瘤相关巨噬细胞也可分泌。基于M1型与M2型巨噬细胞的作用不同,本实验拟通过体外培养人单核细胞,将其诱导成M2型巨噬细胞,并继续诱导M2型巨噬细胞观察是否向M1型巨噬细胞转化。将人单核细胞系THP-1细胞分别诱导为M1型和M2型巨噬细胞并与食管癌相关淋巴内皮细胞(lymphatic endothelial cell,LEC)共培养,以单独培养的食管癌相关LEC作为对照组;通过CCK-8法、Transwell小室迁移实验及基质胶三维培养法观察不同类型的巨噬细胞对食管癌相关LEC的增殖、迁徙和成环能力的影响,同时通过ELISA法来检测不同类型巨噬细胞分泌VEGF-C的情况;通过Western Blot法检测食管癌相关LEC经条件培养基培养后VEGFR-3蛋白表达情况;通过q RT-PCR法来检测VEGFR-3m RNA的表达情况,探讨M2型巨噬细胞能否向M1型转化,及探讨不同类型的巨噬细胞对食管癌相关LEC增殖、迁移和成环能力的影响。方法1诱导人单核细胞向M2型巨噬细胞转化,并诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化1)采用密度梯度离心法及磁珠阳性分选法获得人单核细胞,经重组人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导其转化为M2型巨噬细胞,并采用流式细胞仪进行鉴定。2)M2型巨噬细胞经干扰素-γ(IFN-γ)和磷酸脂多糖(LPS)共同诱导向M1型巨噬细胞转化,并采用流式细胞仪进行鉴定。2将M1型和M2型巨噬细胞与食管癌相关淋巴内皮细胞共培养并检测相关指标1)将THP-1细胞经佛波酯(PMA)诱导2d后,经IFN-γ和LPS诱导2d为M1型巨噬细胞;经白介素-4(IL-4)诱导2d为M2型巨噬细胞,采用流式细胞仪进行鉴定。2)分别留取M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的条件培养基。3)以M1型巨噬细胞条件培养基培养的食管癌相关LEC作为M1组;以M2型巨噬细胞条件培养基培养的食管癌相关LEC作为M2组;以RM1640完全培养基培养的食管癌相关LEC作为对照组。4)采用CCK-8法检测各组不同培养基对食管癌相关LEC的增殖能力的影响。5)采用Transwell小室来观察各组不同培养基培养对食管癌相关LEC迁移能力的影响。6)采用基质胶法来观察各组不同培养基培养对食管癌相关LEC成环能力的影响。7)采用ELISA法检测M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞上清液中VEGF-C水平。8)采用Western Blot法检测各组不同培养基培养后的食管癌相关LEC中VEGFR-3蛋白表达水平。9)采用q RT-PCR法检测各组不同培养基培养培养后的食管癌相关LEC中VEGFR-3m RNA表达情况。3统计学处理应用SPSS17.0软件进行处理数据。对于两样本定量资料我们选用t检验。对于单因素定量资料多组样本之间的比较我们采用单因素方差分析法,多组均数之间的两两比较则采用LSD-t法,检验水准ɑ=0.05。结果1.经M-CSF诱导后M2型巨噬细胞阳性表达率为(66.37±2.67)%,明显多于M1型巨噬细胞阳性表达率(13.37±4.41)%,差异有统计学意义(P0.05)。而M2型巨噬细胞再经IFN-γ和LPS诱导后M1型巨噬细胞的阳性表达率为(48.57±5.98)%,明显高于M2型巨噬细胞的阳性表达率(25.83±1.95)%,差异有统计学意义(P0.05),且M1型巨噬细胞的阳性表达量较单核细胞经M-CSF诱导后明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。2.THP-1细胞经PMA诱导后,经IFN-γ与LPS诱导为M1型巨噬细胞;经IL-4诱导为M2型巨噬细胞。经流式细胞仪检测M1型巨噬细胞的CD16阳性表达率为(73.57±2.58)%,M2型巨噬细胞的CD163阳性表达率为(86.3±2.66)%。3.CCK-8法检测各组不同培养基对食管癌相关LEC增殖能力的影响:各组增殖能力M2组对照组M1组,M2组与M1组及与对照组两两比较差异具显著性(P0.05)。而对照组与M1组进行比较差异无显著性(P0.05)。4.Transwell小室观察各组不同培养基对食管癌相关LEC迁移能力的影响:各组穿膜细胞数M2组对照组M1组,M2组与M1组及与对照组两两比较差异具有统计学意义(P0.05)。对照组与M1组进行比较具有统计学意义(P0.05)。5.基质胶实验法三维培养观察各组不同培养基培养对食管癌相关LEC成环能力的影响:各组的成环数M2组对照组M1组,M2组与M1组及与对照组两两比较差异具有统计学意义(P0.05)。对照组与M1组进行比较具有统计学意义(P0.05)。6.ELISA法检测M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞上清液中VEGF-C的水平结果:M2组对照组M1组,M2组与M1组及与对照组两两比较差异具显著性(P0.05)。而对照组与M1组进行比较差异无显著性(P0.05)。7.Western Blot法检测各组不同培养基培养后的食管癌相关LEC中VEGFR-3蛋白表达水平:M2组对照组M1组,M2组与M1组及与对照组两两比较差异具有统计学意义(P0.05)。对照组与M1组进行比较具有统计学意义(P0.05)。8.采用q RT-PCR法检测各组不同培养基培养后的食管癌相关LEC中VEGFR-3m RNA表达水平:M2组VEGFR-3m RNA表达量是对照组的3.01倍,M1组是对照组的0.90倍。M2组与对照组及与M1组两两比较均有统计学意义(P0.05),对照组与M1组进行比较无统计学意义(P0.05)。结论1.人M2型巨噬细胞经IFN-γ和LPS诱导可向M1型巨噬细胞转化。2.M2型巨噬细胞可促进食管癌相关淋巴管内皮细胞的增殖,迁移及成环能力,而M1型巨噬细胞则对其迁移和成环能力起抑制作用。3.M2型巨噬细胞可通过分泌VEGF-C,进而促进食管癌相关淋巴内皮细胞的增殖、迁移和成环能力。
【关键词】：食管癌相关淋巴内皮细胞 M1型巨噬细胞 M2型巨噬细胞 肿瘤相关巨噬细胞 血管内皮生长因子-C
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-15
• 中英文缩略词表15-16
• 前言16-19
• 实验材料与方法19-37
• 结果37-45
• 讨论45-51
• 结论51-52
• 参考文献52-54
• 附图54-57
• 综述 巨噬细胞极化分型信号通路及对疾病影响的研究进展57-74
• 参考文献69-74
• 个人简历74-75
• 致谢75

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本文编号：476508