LAMA4及相关IncRNA在前列腺癌组织中的差异表达，以及其对前列腺癌细胞转移能力影响的研究

发布时间：2017-06-24 15:03

  本文关键词：LAMA4及相关IncRNA在前列腺癌组织中的差异表达，，以及其对前列腺癌细胞转移能力影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:利用微阵列基因芯片技术检测前列腺癌(PCa)、和癌旁正常组织中差异表达的m RNA和lnc RNA。观察前列腺癌与癌旁正常组织基因表达的变化,进而发现LAMA4基因及其相应lnc RNA,为前列腺癌转移提供分子层面的新证据,以期为临床前列腺癌的预防、诊疗,以及发病机制提供新理论及新方案。方法:收集2013年8月至2014年8月我院前列腺切除术后临床组织标本共20例,通过改进标本获取方式,运输途径,破碎方法三方面因素,建立从离体组织标本提取高质量总RNA的方法。随后在此方法基础上,通过冰冻切片结合手工显微切割技术在同一前列腺组织标本中分离出PCa、癌旁正常组织各区域的纯净细胞群。采用lnc RNA+m RNA表达谱芯片分析三者间的基因表达差异(生物学重复3次),通过生物信息学的方法筛选出具有显著表达差异的m RNA和lnc RNA,并对结果进行Pathway分析等初步的生物信息学分析,反向Cis-预测lnc RNA的靶基因,在发生显著变化的炎症和/或癌症通路上建立lnc RNA与靶基因的基因网络图。确定LAMA4及其相关lnc RNA的差异表达,并通过收取2014年11月至2015年10月我院前列腺切除术后临床组织标本6例,进行组织标本PCR验证,培养DU145前列腺癌细胞系,22RV1前列腺癌细胞系,使用特异性si RNA,以Lipofectamine TM2000进行转染,进一步采取q RT-PCR验证转染效果,以确定是否转染成功。对于转染后抑制的细胞,通过transwell,划痕实验以及MTT法细胞黏附实验,检测肿瘤细胞的迁移,转移,黏附探寻lnc RNA在此过程中的作用。结果:1.基因表达谱芯片的结果显示:人前列腺癌组织与癌旁正常组织对照相比,有2610个m RNA表达有差异,其中上调689个,下调1921个;同时有2176个lnc RNA表达有差异,其中上调688个,下调1488个。人前列腺增生性炎性萎缩组织与癌旁正常组织相比,有592个m RNA表达有差异,其中上调183个,下调409个;同时有575个lnc RNA表达有差异,其中上调160个,下调415个。人前列腺癌组织与前列腺增生性炎性萎缩组织相比,有1007个m RNA表达有差异,其中上调115个,下调892个;有773个lnc RNA表达有差异,其中上调105个,下调668个。在3种组织类型的共同比较中,有113个m RNA的表达存在显著线性差异,其中上调8个,下调105个;有106个lnc RNA的表达也存在显著线性差异,其中上调11个,下调95个。2.LAMA4基因的m RNA及其lnc RNA在芯片结果中差异表达明显,在组织标本中,组织PCR结果符合芯片结果。3.转染后细胞PCR显示,si RNA敲底lnc RNA和LAMA4 m RNA水平4.细胞功能学实验表明,转染后细胞迁移转移能力明显减弱。结论:1.冰冻切片并HE染色结合“排除法”手工显微切割技术,可经济、有效地鉴定分离出目的细胞亚群,且通过Trizol法提取的总RNA能够满足高通量微阵列技术的质量要求。2.前列腺癌组织验证符合芯片结果,LAMA4及其相关lnc RNA在前列腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P0.05)3.RT-PCR和细胞功能学实验证明,转染后细胞LAMA4 m RNA和相应lnc RNA均下调,并抑制细胞迁移,转移,黏附的功能。
【关键词】：前列腺癌 LAMA4 非编码RNA 转移 黏附
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词表9-10
• 第1章 引言10-14
• 第2章 材料与方法14-25
• 2.1 研究对象14
• 2.2 实验分组14
• 2.3 主要仪器及试剂14-16
• 2.3.1 主要仪器14-15
• 2.3.2 主要试剂15-16
• 2.4 主要溶液配制16
• 2.4.1 H&E染液配置16
• 2.4.2 Trizol16
• 2.4.3 培养基的配置16
• 2.4.4 MTT试剂的配制16
• 2.5 实验方法16-25
• 2.5.1 标本的收集与保存16-17
• 2.5.2 前列腺癌组织与癌旁正常组织的鉴定及分离17
• 2.5.3 Trizol法提取癌组织及癌旁正常组织的总RNA17-18
• 2.5.4 RNA浓度测定18
• 2.5.5 引物设计18-19
• 2.5.6 逆转录c DNA19
• 2.5.7 Real-time PCR检测lnc RNA RP1-142L7.5 的表达水平19-20
• 2.5.8 细胞培养20-21
• 2.5.9 细胞转染21-22
• 2.5.10 划痕实验检测RP1-142L7.5 对DU145，22RV1细胞的影响22-23
• 2.5.11 MTT法检测RP1-142L7.5 对DU145，22RV1细胞黏附的影响23
• 2.5.12 Transwell检测RP1-142L7.5 对DU145，22RV1细胞侵袭能力的影响23-25
• 第3章 结果25-42
• 3.1 镜下组织学表现25-26
• 3.1.1 正常前列腺上皮的镜下表现25-26
• 3.1.2 PCa组织的病理表现26
• 3.2 芯片结果26-35
• 3.2.1 基因表达谱杂交图26-27
• 3.2.2 基因表达谱散点图27-28
• 3.2.3 基因表达差异28-29
• 3.2.4 聚类分析29-30
• 3.2.5 KEGG分析30-32
• 3.2.6 以m RNA为入口的反向lnc RNA预测32-34
• 3.2.7 选取基因34-35
• 3.3 RT-PCR对RP1-142L7.5 大样本进行验证35-37
• 3.4 si RNA干扰后RP1-142L7.5 的表达鉴定37
• 3.5 si RNA干扰后对下游LAMA4基因的影响37-38
• 3.6 Lnc RNA RP1-142L7.5 对细胞迁移功能的影响38-40
• 3.7 Lnc RNA RP13-650J16.1 对细胞黏附功能的影响。40
• 3.8 Lnc RNA RP13-650J16.1 对细胞体外侵袭能力的影响40-42
• 第4章 讨论42-46
• 4.1 LAMA4在肿瘤细胞中发挥的作用42-44
• 4.2 lnc RNA与m RNA之间和蛋白表达的关系44-46
• 第5章 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-58
• 综述 雄激素受体剪切变异体解析58-70
• 参考文献66-70

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