HnRNP L在膀胱癌发生发展中的功能和分子机制研究

发布时间：2017-06-26 07:21

  本文关键词：HnRNP L在膀胱癌发生发展中的功能和分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的：膀胱癌指发生于膀胱黏膜上的恶性肿瘤,其为泌尿系统最常见的恶性肿瘤,在欧美其发病率居男性恶性肿瘤的第四位,为世界6大常见肿瘤之一,在我国其发病率近年来也呈明显上升趋势。膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌两大类。其中70%-90%新确诊的膀胱癌病例均为为非肌层浸润性膀胱癌,在行腔内膀胱肿瘤切除术后,即使严格的膀胱内灌注化疗,依然有约10%-40%的复发率,而在复发病例中有近5%-30%可能进展为肌层浸润性膀胱癌甚至发生转移,此类浸润性膀胱癌患者在行全膀胱切除术后5年生存率仅有为60%-70%。此外,膀胱癌目前主要依赖于膀胱镜检查来监测和诊断,然而由于膀胱镜为侵入性操作,且检查费用昂贵且费时,给患者带来沉重的负担,不能得到患者很好的接受和配合。尿液脱落细胞学检查在发现晚期膀胱癌方面有很高的敏感性,然而在早期敏感性很低,且其诊断与临床病理医师的经验密不可分。总的来说,目前尚缺乏可用于膀胱癌早期诊断、治疗及预测进展的高敏感性和特异性的检查手段及分子标志物,解决这些问题仍依赖于基础研究的重大进展。膀胱癌发生是一个多基因、多因素参与的复杂过程。已知癌基因的激活和抑癌基因的失活与膀胱癌发生关系密切。其中HER-2、H-Ras、Bcl-2、C-myc等基因突变可导致调节细胞生长、DNA修复或凋亡的蛋白抑制基因失活,这些基因的改变使DNA受损的细胞不发生凋亡,导致细胞生长失控,从而促进膀胱肿瘤的发生发展；而抑癌基因P53、RK、P21等失活导致肿瘤细胞增殖不受限制,进一步加速膀胱癌的进展。此外,膀胱癌发生也与编码生长因子或其受体的正常基因扩增或过表达有关,如EGEF表达水平的提高可增加膀胱癌的侵袭及转移能力。这一系列分子生物学改变在膀胱癌发生发展过程中扮演重要角色。然而,现阶段膀胱癌发生发展的许多机制尚不清楚,仍有待于深入的研究阐明。基于此,深入研究膀胱癌的发生发展及转移分子机制,寻找一种敏感性高、特异性强能够预测膀胱癌细胞的生物学行为,作为评估膀胱癌发生发展及转移能力和判断患者预后的指标,从而提高膀胱癌患者的生存率、改善生活质量显得尤为重要。核内不均一核糖核蛋白L(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L,hnRNPL)的基因定位于19q13.2,编码hnRNPL蛋白。HnRNP L是机体表达量丰富且功能多样的可穿梭于胞浆和胞核之间的蛋白质,为核内不均一核糖核蛋白(核蛋白hnRNP)复合体的重要组成部分。HnRNP是一类RNA结合蛋白,其主要集中于细胞核区,通过特异的结构与Pre-mRNA结合,形成Pre-mRNPs复合体,参与mRNA转运、代谢、剪切及表达等过程的调节。已有的文献报道显示hnRNP家族成员参与肿瘤的发生发展及转移等生物学进程,其可调节基因表达、抑制细胞凋亡、促进血管生成及增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。作为hnRNPs家族成员之一的hnRNPL主要通过优先结合CA重复序列或某些CA丰富序列进而发挥调控作用,主要包括在可变剪接过程中调节选择外显子、促进聚腺苷酸化、协助输出无内含子的基因mRNA,促进内部核糖体进位点翻译、调节mRNA稳定性等。已有的文献报道显示hnRNP L的表达失调与肿瘤的关系密切,其在肿瘤中主要发挥促进细胞增殖、迁移、侵袭、粘附等能力。近年来有关hnRNP L在肿瘤中的研究报已证实hnRNP L可参与食管鳞状细胞癌、肝癌、肺癌、转移性结直肠癌和乳腺癌等多种肿瘤发生,如hnRNP L与含有外显子3的caspase-9a前体mRNA优先结合,导致其降解,进而影响caspase-9 mRNA亚型的表达,最终调控非小细胞肺癌发生；在肝癌细胞中干扰hnRNPL的表达后,肿瘤细胞增殖、迁移能力显著减低。HnRNPL参与众多肿瘤生物学行为的调节,然而迄今为止尚未有hnRNPL参与膀胱癌的生物学进程的文献报道。我们前期工作中通过膀胱癌组织芯片的免疫组化检测发现hnRNPL在膀胱癌组织中表达上调,其高表达与膀胱癌进程有密切联系。然而,目前hnRNPL在膀胱癌中的发生发展及转移中的是否也发挥同样的功能至今仍不清楚,hnRNPL在膀胱癌中高表达,其可能的调控机制亦知之甚少。本课题拟检测hnRNPL在膀胱癌中的表达情况,分析其表达与患者相关临床病理参数之间的关系；通过体内外实验对hnRNPL在膀胱癌增殖、凋亡及侵袭转移中的功能进行研究；同时探究hnRNPL在膀胱癌中异常高表达可能的下游作用机制。本研究的开展有助于为膀胱癌生长和转移机制提供新的实验依据及思路；最终可为膀胱癌临床早期诊断、治疗及预后判断提供可靠的新型分子标志物。研究方法：(1) HnRNPL在膀胱癌组织及细胞中的表达采用蛋白免疫印迹(Western blot)和荧光光定量PCR检测hnRNPL在膀胱癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达,检测hnRNPL在正常膀胱移行上皮细胞SV-HUC-1及膀胱癌细胞UM-UC-3、EJ、T24、5637中的表达；(2) HnRNPL在膀胱癌组织表达及其与患者临床参数之间相关性应用免疫组化(IHC)检测膀胱癌石蜡样本中hnRNPL的表达,并分析hnRNPL的表达与肿瘤的分化、分期和临床预后等相关病理参数之间的关系；(3) HnRNPL在膀胱癌中的生物学功能建立hnRNPL稳定干扰和过表达的膀胱癌细胞株,通过CCK-8、平板克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤检测细胞增殖改变情况,利用Transwell实验及划痕愈合实验检测细胞侵袭迁移能力变化,通过流式细胞技术检测细胞周期分布及细胞凋亡的改变；(4) HnRNPL在膀胱癌进展过程中的作用机制运用、Western blot凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-9、Bcl-2、 Bcl2L1、PARP1的改变以及MAPK信号通路(p-ERK1/2、p-P38、p-JNK)及Nrf2、E2F1的激活情况。利用荧光定量PCR和Western blot检测hnRNPL稳定敲低和过表达后EMT标志物(E-cadherin、Vimentin、Claudin-1、ZO-1、β-catenin、 ZEB1、snail)的变化。结果：(1)膀胱癌组织中hnRNPL蛋白的表达水平检测IHC结果显示hnRNPL蛋白阳性表达主要定位于细胞核,呈棕黄色或棕褐色,在74.2%(115/155)的膀胱癌患者中呈阳性表达,正常膀胱组织hnRNPL蛋白表达阳性率低于其配对肿瘤组织；Western blot和qRT-PCR结果显示膀胱癌组织中的hnRNPL蛋白及nRNA表达水平高于其配对的正常膀胱组织；(2) HnRNPL蛋白表达和临床病理参数的关系在膀胱癌组织中,hnRNPL蛋白表达与年龄、TNM分期、临床病理分级及组织学分级明显相关(P0.05),而与患者的性别无明显相关(P0.05)；Kaplan-Meier法分析显示hnRNPL高表达组膀胱癌患者的5年生存率要显著低于低表达组,差异具有统计学意义(Log rank, P0.05);多因素Cox风险比例模型分析显示：hnRNPL是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素(P=0.001)；(3) HnRNPL表达对膀胱癌细胞生物学功能的影响3.1 HnRNPL稳定干扰和过表达的膀胱癌细胞株构建Western blot验证结果表明慢病毒表达载体转染后,成功构建了hnRNPL稳定干扰和过表达的膀胱癌细胞株；3.2 HnRNPL稳定干扰和过表达对膀胱癌细胞增殖能力的影响CCK-8结果显示：与对照组相比,hnRNPL稳定干扰组的细胞生长速度显著下降(P0.05),而过表达组细胞生长速度显著快于对照组(P0.05)；平板克隆形成实验结果显示：与对照组相比,hnRNPL稳定干扰组形成的克隆数量显著减少(P0.05),而过表达组形成的克隆数量显著增加(P0.05)；裸鼠皮下成瘤结果显示：与对照组相比,hnRNPL稳定干扰组肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤重量较轻(P0.05)；3.3 HnRNPL稳定干扰和过表达对膀胱癌细胞EMT表型及迁移能力影响Western blot结果显示在膀胱癌细胞株UM-UC-3和EJ中干扰hnRNPL的表达后上皮标志物E-cadherin的表达上调,而间质标志物Vimentin的表达下调；相反,在UM-UC-3和EJ细胞株中稳定过表达hnRNPL后,上皮标志物E-cadherin的表达下调,而间质标志物Vimentin的表达上调；Transwell迁移实验结果显示：hnRNPL稳定干扰组的细胞较对照组迁移数量明显减少(P0.05),而hnRNPL过表达细胞株迁移数量明显多于对照组(P0.05)。划痕愈合实验结果显示：与对照组相比,hnRNPL稳定干扰组的细胞株迁移速度明显减慢(P0.05),而hnRNPL过表达细胞株迁移速度显著增快(P0.05)；3.4 HnRNPL稳定干扰和过表达对膀胱癌细胞周期分布和细胞凋亡的影响流式细胞术细胞周期检测结果显示：与对照组相比,hnRNPL稳定干扰组的细胞G1期比例明显增加,S期比例明显减少,细胞发生G1期阻滞(P0.05),细胞周期进程明显减慢；而hnRNPL过表达后,与对照组相比,G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例明显增加(P0.05),细胞周期进程明显加快。细胞凋亡检测结果显示：与对照组相比,hnRNPL稳定干扰组的细胞凋亡比例明显增加(P0.05),而hnRNPL过表达细胞株细胞凋亡比例显著增加(P0.05)；3.5 HnRNPL在膀胱癌中的作用机制Western blot结果显示膀胱癌细胞株UM-UC-3和EJ中干扰hnRNPL表达后,caspase-3、caspase-6、caspase-9、Bcl-xL表达上调,而Bcl-2、PARP1的表达下调；在两株细胞中稳定过表达hnRNPL后,结果则相反。HnRNPL表达干扰后p-ERK1/2、p-P38、p-JNK、NRF2、E2F1表达下调,在两株细胞中稳定过表达hnRNPL后,结果则相反；JNK在hnRNPL稳定干扰和过表达同对照比较变化不明显。qRT-PCR结果显示稳定干扰hnRNPL后E-cadherin的nRNA表达水平上调,而Vimentin的mRNA表达水平下调,相应转录因子ZEB1、ZEB2、snail、slug、mRNA表达水平均下调；Western blot结果表明干扰hnRNPL的表达后,E-cadherin, claudin-1及ZO-1表达上调,而Vimentin、ZEB1, β-catenin表达下调；过表达hnRNPL后结果与之相反,且过表达后E-cadherin转录抑制因子snail表达水平上调。结论：(1)膀胱癌组织中hnRNPL的表达水平显著高于癌旁非肿瘤组织,hnRNPL的表达水平与组织学分级、临床分期、TNM分期以及预后密切相关；hnRNPL高表达患者,预后较差；(2) HnRNPL干扰可抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移能力,抑制EMT表型转化,诱导肿瘤细胞的凋亡,使细胞周期阻滞在G1期；而过表达hnRNPL可促进膀胱癌细胞EMT表型转化、侵袭和迁移能力,抑制肿瘤细胞凋亡,使细胞周期进程加快；(3) HnRNPL可能通过调节P53/Bcl2/Caspase信号通路和IMAPK信号通路活性及E2F1等参与膀胱癌细胞的增殖、凋亡及迁移。
【关键词】：膀胱癌 hnRNP L 预后 增殖 凋亡 迁移
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-24
• 技术路线24-25
• 第一章 HnRNP L在人膀胱癌组织中的表达及其临床意义25-44
• 一. 材料与方法25-34
• 二. 结果34-42
• 三. 结论42
• 四. 讨论42-44
• 第二章 HnRNP L基因干扰和过表达对膀胱癌细胞生物学功能的影响44-66
• 一. 材料与方法44-49
• 二. 结果49-63
• 三. 结论63
• 四. 讨论63-66
• 第三章 膀胱癌中hnRNP L调控机制的初步研究66-84
• 一. 材料与方法66-71
• 二. 结果71-79
• 三. 结论79
• 四. 讨论79-84
• 全文总结84-85
• 参考文献85-95
• 在读期间发表的论文95
• 在读期间参与课题研究95-96
• 致谢96-97

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