双重测序法结合芯片捕获检测低频突变的方法的建立

发布时间：2017-06-26 07:22

  本文关键词：双重测序法结合芯片捕获检测低频突变的方法的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：液体活检,即通过血液或者体液检测肿瘤循环DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),获得肿瘤基因突变的信息,具有非侵入性、取样方便、可持续监测的特点,是肿瘤个体化治疗的重要工具。由于ctDNA具有的含量一般低于1%,并且肿瘤呈现高度异质性,而新一代测序技术存在约1%的错误率,使突变信息难以被准确检测到。双重测序法利用文库片段两端的随机标签组合去除测序错误,可以将测序准确度提高10000倍以上。因此本文利用6个已知突变频率的尿液来验证双重测序法结合芯片捕获技术的灵敏度,并用1例膀胱癌手术前后的尿液样本来证明该方法在肿瘤液体活检的可行性。本文探讨研究了双重测序法结合芯片捕获技术的灵敏度,以及方法在真实样本检测中的可行性。方法的灵敏度:在正常人尿液提取的DNA中加入1%,0.1%,0.01%的胃癌823细胞系DNA(拥有90个已知的突变位点)作为模拟样本,通过双重测序法和包含胃癌细胞系DNA 90个突变的芯片来建库捕获,检测混合样品里的突变位点。检测膀胱癌突变的可行性:用双重测序法结合芯片捕获技术对1例膀胱癌患者术前和术后的尿液DNA,一个正常人的尿液DNA进行检测,比较3个样品的基因突变情况。灵敏度测试的结果显示,在3个梯度的突变率中均能检测出突变,测序深度达到8000x时,含1%突变的样本的真实突变检出率大于66%,准确率大于93%。该方法用于检测膀胱癌突变时,芯片捕获率约60%,在病人术前、术后和正常人的尿液DNA中分别找到了39个,1个和4个突变位点。本研究说明,双重测序法是一个能够检测到0.01%低频突变的方法,结合芯片捕获技术,可特异性地检测膀胱癌尿液样本中疾病相关的基因突变位点。双重测序结合芯片捕获技术检测低频突变,是一个有发展潜力并且比较新的方法,需要更多的样本和数据支持,让它可以更好更广泛地应有。
【关键词】：肿瘤循环DNA 低频突变 双重测序 芯片捕获
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 第一章 绪论9-27
• 1.1 前言9
• 1.2 肿瘤与基因突变的概述9-13
• 1.2.1 肿瘤基因突变检测的进展10-12
• 1.2.2 肿瘤个性化治疗的发展12-13
• 1.3 无创肿瘤基因检测技术的发展13-16
• 1.3.1 血液ctDNA无创检测技术13-15
• 1.3.2 粪便和尿液无创检测技术15-16
• 1.4 低频检测技术的发展16-18
• 1.4.1 COLD-PCR技术16-17
• 1.4.2 Digital PCR技术17
• 1.4.3 高分辨率熔解曲线分析技术17-18
• 1.5 本课题研究背景和研究内容18-27
• 1.5.1 研究背景18
• 1.5.2 研究内容18-25
• 1.5.3 研究方案25-27
• 第二章 灵敏度测试27-43
• 2.1 实验材料27-29
• 2.1.1 样品27
• 2.1.2 主要仪器设备27-28
• 2.1.3 主要试剂28
• 2.1.4 主要耗材28-29
• 2.2 实验方法29-36
• 2.2.1 提取尿液基因组DNA29-30
• 2.2.2 样品检测30
• 2.2.3 芯片设计30
• 2.2.4 文库构建30-34
• 2.2.5 测序34
• 2.2.6 下机数据处理34-36
• 2.3 实验结果36-40
• 2.4 讨论40-43
• 第三章 临床可行性测试43-57
• 3.1 实验材料43
• 3.1.1 样品43
• 3.1.2 主要仪器设备43
• 3.1.3 主要试剂43
• 3.1.4 主要耗材43
• 3.2 实验方法43-46
• 3.2.1 接头退火方法的比较43-45
• 3.2.2 临床样品的检测应用45-46
• 3.3 实验结果46-52
• 3.3.1 不同接头退火方法的比较46-50
• 3.3.2 临床样品的检测应用50-52
• 3.4 讨论52-57
• 结论57-58
• 参考文献58-63
• 附录63-67
• 致谢67-68
• 附件68

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