肝细胞生长因子降低EGFR野生型肺腺癌细胞对上皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂—吉非替尼的敏感性

发布时间：2017-06-26 13:01

  本文关键词：肝细胞生长因子降低EGFR野生型肺腺癌细胞对上皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂—吉非替尼的敏感性，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景及目的：非小细胞肺癌(NSCLC)占据肺癌的85%。在非小细胞肺癌病人中,超过65%的病人会有局部进展和远处转移。很不幸的是,少于15%的肺癌患者能够存活超过5年。在过去的十几年中,特定基因突变检测在肺癌中的应用,引领肺癌治疗进入新的靶向时代。针对EGFR及ALK (anaplastic lymphoma kinase)在肺癌治疗中带来很好的疗效。EGFR-TKI在EGFR突变的非小细胞肺癌及crizotinib在ALK重排的非小细胞肺癌中的治疗反应,生存质量,无进展生存期相比较于化疗而言,都有很大的提升。EGFR-TKI如吉非替尼,厄洛替尼,阿法替尼已被确立为主要的标准治疗。这些治疗尤其在EGFR突变(外显子19位缺失突变,L858异位突变)的非小细胞肺癌中效果显著。亚洲肺腺癌患者中超过50%会发现EGFR突变。尽管大部分的EGFR突变肺癌患者在应用TKI初期效果显著,但是都不可避免的发生获得性抵抗。因此固有耐药和获得性耐药成为影响患者疗效的重要障碍。目前,已发现多个EGFR-TKI耐药机制。近期的研究中,新一代的EGFR-TKI在EGFR T790M突变(约占耐药肿瘤的50%)的肺癌中有取得了较好的疗效。而之前我们的研究报道HGF作为MET受体的配体,会诱导EGFR突变的肺腺癌细胞对吉非替尼或是新一代EGFR-TKIs抵抗,这一现象是通过MET/Gab1/PI3K/AKT途径实现的,而不需要经过ErbB3,尽管ErbB3在MET扩增导致的吉非替尼抵抗中有重要作用。我们同时又发现,MET抑制剂E7050可以成功克服HGF诱导的EGFR-TKI抵抗。对于野生型的EGFR进展期肺癌患者而言,化疗是主要的治疗手段。然而,随着治疗的进行常常会发生化疗抵抗,这会大大降低病人对化疗的临床受益度。尽管EGFR-TKI在EGFR野生型的非小细胞肺癌患者中的效果尚有争议,但是很多临床试验显示,在化疗后进展的患者中,使用EGFR-TKI可以获得一定的生存获益。因此,某些指南推荐在EGFR野生型的非小细胞肺癌患者中,EGFR-TKI可作为可选择的二线治疗手段。考虑到不可避免的药物抵抗,我们猜想这些耐药机制也可能存在于野生型EGFR突变的肺癌中,如果可以在EGFR-TKI治疗前就考虑到潜在的耐药并进行处理,那么这类病人可能将从EGFR-TKI治疗中获得更多的受益。由于之前在EGFR突变的肺癌细胞中已经证实HGF/MET是一个重要的导致EGFR-TKI耐药的机制,因此本研究中我们进一步研究了HGF是否也会导致EGFR野生型肿瘤耐药。我们的研究发现,HGF通过PI3K/Akt, MAPK途径显著降低EGFR野生型肺癌细胞株对吉非替尼的敏感性。小分子MET抑制剂,PHA-665752完全逆转了HGF导致的EGFR-TKI耐药。我们的研究结果表明,联合应用EGFR-TKI和MET抑制剂或者抑制下游信号分子PI3K、MEK,可能是EGFR野生型肺癌患者可选择的二、三线治疗策略。方法：1.EGFR野生型肺腺癌细胞对EGFR-TKI敏感性的检测检测EGFR野生型肺腺癌细胞A549,H358对EGFR-TKI的敏感性。这两株细胞均为KRAS突变细胞。依据MTT使用说明书,检测A549和H358细胞在不同浓度的EGFR-TKI(吉非替尼和厄洛替尼)下,细胞的增殖情况。HGF处理后EGFR野生型肺腺癌细胞对EGFR-TKI敏感性的检测应用HGF提前处理细胞30分钟后,加入不同浓度的EGFR-TKI gefitinib,继续培养72小时后,依据MTT使用说明书,检测在有HGF存在情况下两种EGFR野生型肺腺癌细胞A549,H358对吉非替尼的敏感性变化：同时应用HGF中和性抗体预处理,检测其是否能够恢复这两种细胞对吉非替尼的敏感性;联合应用MET小分子抑制剂PHA-665752,检测其是否能够恢复HGF处理后的细胞对吉非替尼的敏感性。检测EGFR野生型细胞中MET,EGFR,ErbB3的表达情况。提取EGFR野生型细胞A549,H358的总蛋白,应用BCA试剂盒检测蛋白浓度,配置同等蛋白浓度样品后,加入SDS-PAGE loading buffer经95摄氏度高温加热后进行蛋白变性,进而通过凝胶电泳,转膜,牛奶封闭后,4摄氏度孵育一抗过夜,室温孵育二抗,经洗膜后,采用ECL法检测这两种细胞的MET,EGFR,ErbB3及其下游信号的蛋白表达情况。2.检测吉非替尼和/或HGF和/或MET抑制剂处理后A549,H358细胞中MET,EGFR,ErbB3及其下游信号蛋白的表达情况。同样利用Western blotting方法检测各种处理后,EGFR野生型细胞株中MET, EGFR,ErbB3及其下游信号的蛋白表达情况。3.检测MET, EGFR, ErbB3三者之间的关系利用免疫沉淀技术检测HGF和或吉非替尼处理后的MET与EGFR, ErbB3三者之间的关系。4.检测特异性敲除MET或特异性敲除ErbB3能否恢复细胞对吉非替尼的敏感性利用阳离子脂质体的方法转染EGFR野生型细胞A549和H358,按照lip2000使用说明书进行操作,当细胞融合度达到70%时,转染专用培养基Opti-MEMI稀释scramble, MET siRNA, ErbB3 siRNA,以及lipofectamine 2000,转染用SIRNA稀释液与lipofectamine 2000稀释液分别混合后,室温静置20分钟,加入贴壁的细胞培养板中,于细胞培养箱内孵育4-6小时后,细胞换液,换成含有抗生素的完全培养基,则转染完成。转染后72小时进行对各个样品进行检测,Western Blotting检测其相应蛋白的表达情况以及下游信号通路蛋白的表达情况。MTT检测转染后的EGFR野生型细胞A549和H358对吉非替尼的敏感情况。5.检测高表达HGF后的EGFR野生型细胞株对吉非替尼的敏感性变化构建高表达HGF基因的肺腺癌细胞株。同siRNA转染相同,应用阳离子脂质体的方法携带HGF基因,转染EGFR野生型肺腺癌细胞。当转染完成后,应用人HGF ELISA检测试剂盒来检测转入HGF基因前后的细胞分泌HGF的情况。同时利用转染前后的细胞对吉非替尼敏感性进行检测,检测方法同上,按照MTT的操作执行。6.检测细胞下游信号PI3K/AKT,MAPK通路在野生型肺癌细胞对吉非替尼耐药中的作用利用western blotting同时检测PI3K小分子抑制剂GSK2126458和PF04691502在EFGR野生型和突变型细胞PC9中对PI3K/AKT磷酸化的抑制情况,检测MEK抑制剂AZD-8330及TAK-733对两种细胞的ERK1/2磷酸化的抑制情况。应用MTT检测PI3K小分子抑制剂及MEK小分子抑制剂对EGFR突变细胞,EGFR野生型细胞的生长抑制情况。具体方法如前所示。7.统计分析采用SPSS13.0软件进行统计分析,两样本均数的比较采用两独立样本的t检验(Independent-Sample T Test),两组以上样本均数比较采用完全随机设计资料的方差分析(One-Way ANOVA)。结果：1.EGFR野生型肺腺癌细胞对EGFR-TKI的中度敏感两种EGFR野生型细胞A549,H358经不同浓度的EGFR-TKI(吉非替尼,厄洛替尼)处理,经MTT检测细胞的增殖活力。结果显示,两种EGFR-TKI药物对EGFR野生型细胞增殖均表现出中等抑制作用。2.HGF降低EGFR野生型细胞对吉非替尼的敏感性HGF提前处理EGFR野生型细胞30分钟后再用不同浓度的吉非替尼处理A549、H358细胞,MTT检测发现经HGF处理后的细胞对吉非替尼产生抵抗作用；若同时应用HGF中和性抗体/空白IgG作用HGF处理后的细胞,再检测细胞对吉非替尼的敏感性,发现应用了HGF中和性抗体后的细胞会恢复细胞对吉非替尼的敏感性,而使用空白抗体的细胞则仍对吉非替尼耐药。这就说明HGF会降低EGFR野生型细胞对吉非替尼的敏感性。3.EGFR野生型细胞中表达MET,EGFR,ErbB3通过western blotting检测到EGFR野生型细胞A549,H358细胞中均表达MET,EGFR,ErbB3并且有不同程度的磷酸化,同时发现其下游信号蛋白AKT及ERK1/2亦有磷酸化。4.HGF通过MET介导下游信号蛋白AKT及ERK1/2的活化降低EGFR野生型细胞对吉非替尼的敏感性Western blotting检测各种处理组后的蛋白显示,吉非替尼可以明显抑制MET,EGFR,ErB3,Akt及ERK1/2的磷酸化。单独HGF或PHA-665257处理均不能影响EGFR,ErB3的磷酸化。然而HGF可以激活MET,MET的磷酸化会被PHA-665257抑制。重要的是,即使在吉非替尼存在的情况下,HGF亦可以恢复Akt及ERK1/2的活化,但不能影响EGFR,ErB3的活化。进一步联合PHA-665257和吉非替尼会抑制MET活化,并同时抑制下游Akt及ERK1/2的磷酸化。这些结果表明,与EGFR突变的肺癌细胞相同,HGF导致EGFR野生型细胞对吉非替尼敏感性下降是通过MET介导的下游Akt及ERK1/2的活化实现的。5.HGF导致EGFR野生型细胞对吉非替尼敏感性下降与ErbB3无关在EGFR突变的肺癌中MET基因扩增及HGF作用均可以导致EGFR-TKI耐药,但是ErbB3活化仅仅发生在MET基因扩增导致的耐药,并不存在于HGF导致的耐药中。那么在EGFR野生型的肺癌细胞中是否也是如此呢?Western Blotting显示在吉非替尼存在的情况下,HGF可以恢复Akt及ERK1/2的活化,但不能影响EGFR,ErB3的活化。并且在免疫沉淀实验中,不论用吉非替尼处理还是用HGF处理,沉淀MET均不能沉淀下ErbB3。相反,MET本身与EGFR结合,而这种结合可以被吉非替尼所抑制。这就表明MET与EGFR的结合与EGFR的磷酸化状态相关。进一步HGF在吉非替尼抑制的情况下不能够恢复MET与EGFR的关系。这些结果均证明HGF导致EGFR野生型细胞对EGFR-TKI敏感性下降是通过MET信号途径发挥作用的,而非通过ErbB3实现的。6.特异性敲除MET,而不是ErbB3可以恢复细胞对吉非替尼的敏感性,这一现象是通过抑制HGF-介导的Akt和ERKl/2磷酸化实现的。用特异性ErbB3 siRNA敲除后不能影响HGF诱导后细胞对吉非替尼的敏感性,亦不能抑制HGF导致EGFR野生型细胞H358及A549的Akt, ErbB3的磷酸化。相反,下调MET的表达可以恢复细胞对吉非替尼的敏感性,同时亦可以抑制AKT及ErbB3的磷酸化。这些结果表明HGF导致的EGFR野生型肺癌细胞对吉非替尼敏感性降低是通过MET磷酸化进而恢复AKT及ErbB3的磷酸化,与ErbB3无关。7.高表达HGF的野生型EGFR肺腺癌细胞会降低对吉非替尼的敏感性将HGF基因转染肺腺癌细胞。在转染之前,H358及A549不分泌HGF；转染HGF基因后可检测到高水平的HGF分泌。同预测一致,转染HGF的细胞会对吉非替尼产生明显的抵抗,空转载体的细胞则不会出现这一现象。同时,经MET小分子抑制剂PHA665752处理后,转入HGF基因的细胞又会恢复对吉非替尼的敏感性。这些结果均表明在EGFR野生型的肺腺癌细胞中,肿瘤细胞来源的HGF会降低细胞对吉非替尼的敏感性。8.野生型EGFR肺癌细胞中,PI3K/Akt及MAPK信号通路在细胞对吉非替尼抵抗中发挥重要作用。有研究表明PI3K/Akt信号通路在EGFR突变的非小细胞肺癌细胞获得性耐药中发挥重要作用。因此,我们利用P13K抑制剂和MEK抑制剂来确认在EGFR野生型的非小细胞肺癌中这PI3K/Akt及MAPK及其下游信号通路是否也同样发挥重要的作用。P13K抑制剂GSK2126458和PF04691502能够明显抑制Akt的磷酸化,同时可以明显的抑制EGFR突变细胞PC9及EGFR野生型细胞A549的生长。然而MEK抑制剂AZD-8330和TAK-733尽管可以很好的抑制ERK1/2的磷酸化表达,在抑制细胞生长方面,对于EGFR突变型细胞PC9的抑制远不如对野生型细胞A549的抑制。这表明同EGFR突变型细胞相反,PI3K/Akt及MAPK信号通路在EGFR野生型细胞中均发挥重要作用。结论：1.HGF降低EGFR野生型肺腺癌细胞对吉非替尼的敏感性2.HGF降低EGFR野生型细胞对吉非替尼的敏感性是直接通过恢复Akt及ERK1/2的磷酸化实现的3.特异性敲除MET,而不是ErbB3可以恢复细胞对吉非替尼的敏感性,这一现象是通过抑制HGF-介导的Akt和ERK1/2磷酸化实现的。4.高表达HGF的野生型EGFR肺腺癌细胞会降低对吉非替尼的敏感性5.野生型EGFR肺癌细胞中,PI3K/Akt及MAPK信号通路在细胞对吉非替尼抵抗中发挥重要作用。
【关键词】：HGF EGFR野生型肺癌细胞 EGFR-TKI敏感性
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-16
• 前言16-26
• 1. 材料与设备26-28
• 1.1 细胞及药物26
• 1.2 主要试剂26-27
• 1.3 主要缓冲液27
• 1.4 主要设备27-28
• 2. 方法28-35
• 2.1 细胞培养28
• 2.2 药物配置28
• 2.3 细跑转染28-29
• 2.4 MTT细胞X椫呈笛榧觳
  
  本文编号：486189
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