ShRNA沉默ARD1基因对大肠腺癌裸鼠移植瘤生长及凋亡相关蛋白表达的影响

发布时间：2017-06-26 21:11

  本文关键词：ShRNA沉默ARD1基因对大肠腺癌裸鼠移植瘤生长及凋亡相关蛋白表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]N端乙酰转移酶(N-acetyltransferase)在真核生物中具有极为重要的生物学功能,人ARD1 (human arrest defective 1,hARD1)基因编码的N端α位乙酰基转移酶10蛋白(N-α- acetyltransferase 10 protein,Naa10p)是NatA的催化亚基。hARD1广泛参与机体的生物学过程,可以将乙酰coA的乙酰基(-CO-CH3)转移到新生多肽N端。hARD1在调控细胞凋亡中起着重要作用,与大肠癌的发生、发展有着密切的关系。本研究探讨ShRNA沉默ARD1基因对大肠腺癌裸鼠移植瘤的生长及凋亡相关蛋白表达的影响。进而为诊断和治疗大肠癌提供全新的治疗理念和治疗措施。[方法]1、大肠腺癌SW620细胞株的复苏与培养。2、干扰质粒(pENTRTM/U6-hARDl-shRNA) hARD1的构建。3、将成功构建的质粒pENTRTM/U6-hARD 1-shRNA及空载质粒pENTRTM/U6-NC经脂质体分别转染SW620细胞。通过G418 (Geneticin,遗传霉素)筛选培养基中具有稳定表达的细胞系。然后依次将筛选出的干扰质粒整合的细胞克隆、空载质粒整合的细胞克隆及未转染的细胞作为实验组、阴性对照组和空白对照组,观察细胞的形态学变化。4、将裸鼠随机分为3组,每组8只,选取裸鼠前肢腋窝中部外侧皮下为注射点,三组分别为：皮下注射稳定表达的pENTRTM/U6-hARD1-shRNA细胞为实验组,皮下注射稳定表达的pENTRTM/U6-NC的SW620细胞为阴性对照组,皮下注射未转染的SW620细胞为空白对照组,精心饲养并随时观察三组移植瘤生长状况。5、Realtime-qPCR法检测三组大肠腺癌裸鼠移植瘤中P53和Bcl-2中mRNA的表达情况。6、使用蛋白质印迹法(Western blot)检测三组大肠腺癌裸鼠移植瘤组织中ARD1的表达情况,不同蛋白表达水平用目的条带灰度与内参GAPDH条带的灰度比值定量表示。7、使用免疫细胞化学法检测三组大肠腺癌裸鼠移植瘤细胞中凋亡相关蛋白P53、 Bcl-2的表达水平。免疫组织化学染色用SP法。以半定量法判定结果,对每例标本随机选取3个不同高倍视野(各计100个细胞),计算肿瘤细胞中p53、bcl-2表达的阳性细胞数。p53、bcl-2蛋白阳性细胞的计算。阳性结果判断标准：Bcl-2阳性为细胞质出现棕黄色颗粒,p53以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达,参考免疫组化评分标准：无表达,0分;50%细胞阳性表达或染色较浅,1分；≥50%阳性,2分。0-1分记为阴性(一),2分记为阳性(+)。8、经四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测三组大肠腺癌裸鼠移植瘤组织细胞增殖的情况。9、应用spssl9.0软件对所得数据进行统计分析,数据非正态分布或方差不齐,以中位数(四分位数间距)表示,数据正态分布及方差齐性以均数±标准差表示,两组间独立样本采用两独立样本t检验,P0.05为差异有统计学意义。[结果]1.SW620细胞株在体外培养成功并且生长良好。2.成功构建hARD1干扰质粒,经G418筛选出各组转染稳定的细胞系。3.(1)随着时间的推移,三组裸鼠瘤体体积逐渐增大。本实验三组共计24只裸鼠除空白组有一只死亡外均成瘤,成瘤率达95.83%。连续观察三周后采用颈椎脱臼法将裸鼠处死,仔细分离皮下移植瘤,测量并记录移植瘤质量和体积(每次注射前用游标卡尺测量肿瘤最长径和最短径,并称瘤体质量。肿瘤体积(V)=最长径×最短径×最短径/2)。结果：发现实验组瘤体质量及体积明显小于阴性对照组和空白对照组,实验组与阴性对照组、实验组与空白对照组裸鼠移植瘤成瘤体质量及体积均差异明显,具有统计学意义(P0.05)；阴性对照组与空白对照组裸鼠移植瘤成瘤体质量及体积差异尚不明显,无统计学意义(P0.05)。(2)前2周无一裸鼠死亡,第18天空白对照组有1例死亡。原因与肿瘤巨大、发生严重的恶液质有关。4. Realtime-qPCR采用2-△△ct法计算相对表达量,对三组大肠腺癌裸鼠移植瘤组织P53、Bcl-2 mRNA的表达分析,实验组的P53的表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组；Bcl-2及转录产物的表达明显低于阴性对照组和空白对照组。5. Western blot法检测三组大肠癌组织中hARD1蛋白的表达情况对三组大肠腺癌裸鼠移植瘤细胞中hARD1蛋白相对表达进行灰度值分析表明：三组均有hARD1的表达,实验组较阴性对照组和空白对照组电泳条带明显减弱。6.p53、bcl-2蛋白的表达三组移植瘤瘤体组织中p53、bcl-2的阳性表达率实验组分别为87.5%(7/8)、37.5%(3/8)；阴性对照组分别为37.5%(3/8)、50.0%(4/8)；空白对照组分别为28.57%(2/7)、85.71%(6/7)。p53的阳性表达率实验组与阴性对照、实验组与空白对照组差异有统计学意义(P0.05)；阴性对照组与空白对照组p53的阳性表达率差异不明显(P0.05), bcl-2的阳性表达率在实验组和阴性对照组、阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P0.05);实验组与空白对照组本实验差异有统计学意义(P0.05)。7.MTT检测三组大肠腺癌裸鼠移植瘤组织细胞增殖的情况本方法原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。可间接反映活细胞数量。瘤体从裸鼠身上取出后的48h检测三组细胞的吸光值(A450),计算出抑制率。其结果是：实验组的抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组(P0.05),[结论]1.本实验证实shRNA干扰技术沉默ARD1基因后的大肠腺癌裸鼠移植瘤组织中,在转录水平上p53的表达水平上调、Bc1-2的表达往往受到抑制；在蛋白水平上促进P53的表达,而对bcl-2表达影响作用不明显。2. shRNA沉默ARD1基因可以抑制大肠腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长,为明确shRNA沉默ARD1基因在大肠癌中的作用机制提供了理论依据。3.通过本研究证实shRNA沉默ARD1后可不同程度调控凋亡相关蛋白的表达,从而抑制大肠腺癌裸鼠移植瘤细胞的生长、促进其凋亡。
【关键词】：人停滞缺陷蛋白1 RNA干扰 大肠癌 裸鼠 移植瘤 p53 bcl-2
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-21
• 实验材料及方法21-36
• 结果36-46
• 讨论46-50
• 结论50-51
• 参考文献51-55
• 附录55-57
• 综述57-66
• 参考文献63-66
• 攻读学位期间获得的学术成果66-67
• 致谢67

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本文编号：487601