长链非编码RNA—UCA1影响胃癌进展的机制研究

发布时间：2017-06-26 22:14

  本文关键词：长链非编码RNA—UCA1影响胃癌进展的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)是一类无蛋白编码功能的基因组转录本。lnc RNA通过多种调控机制影响生物体的正常生物学过程和肿瘤等疾病的发生发展。本研究通过转录组芯片和RNA测序(RNA sequencing,RNAseq)数据分析,筛选出与胃癌相关的lnc RNA。我们发现lnc RNA-尿路上皮癌相关1(urothelial cancer associated 1,UCA1)在胃癌中高表达并探讨其影响胃癌进展的可能机制。方法1.利用多组转录组表达芯片和RNAseq数据分析UCA1在胃癌组织中的表达水平。利用在线工具c Bio Portal(http://www.cbioportal.org/)分析UCA1基因在胃癌中拷贝数的变异情况;癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据分析UCA1表达水平与胃癌临床病理因素的关联性。2.实时定量RT-PCR技术检测UCA1在胃癌细胞株中的相对表达水平,并以胃癌细胞株AGS为模型,采用RNA-荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)分析UCA1在AGS细胞中的定位情况。3.利用si RNA瞬时下调UCA1表达,MTT检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期和凋亡。4.利用慢病毒sh RNA稳定下调UCA1表达,细胞计数、高内涵分析和平板克隆实验检测细胞增殖;细胞划痕、高内涵分析实验和Transwell实验分别检测细胞迁移和转移。5.分析TCGA的mi Rseq数据中差异表达的mi RNA,并预测它们与UCA1的相互作用关系。6.蛋白质质谱技术分析受UCA1调控的蛋白质。结果1.胃癌转录组芯片数据和RNAseq数据分析均表明,UCA1在胃癌中高表达;它的表达水平与其基因组变异和胃癌患者的临床病理因素均无关。2.相对于正常胃黏膜上皮细胞GES,UCA1在胃癌AGS细胞中显著高表达。RNA-FISH实验证明它主要定位在细胞质中。3.利用si RNA沉默UCA1后明显抑制胃癌细胞增殖,阻滞细胞于G1/S期,但并未诱导细胞凋亡。机制研究发现,UCA1能够通过调控周期素依赖激酶抑制剂1B(cyclin-dependent kinase inhibitor 1B,CDKN1B)和细胞分裂周期蛋白25B(cell division cycle 25B,CDC25B)改变细胞周期分布影响细胞增殖。4.sh RNA稳定下调UCA1表达后抑制胃癌细胞增殖、迁移和转移。5.发现mi R-143是潜在的UCA1相互调控分子,且下调UCA1能明显降低mi R-143的下游靶分子己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)的表达水平。6.质谱结果表明,下调UCA1能够改变与肿瘤相关的多种信号通路,如细胞周期、细胞黏附和TP53信号通路等。结论基于分析胃癌转录组芯片和RNAseq数据,我们筛选出与胃癌细胞增殖、迁移和转移相关的lnc RNA-UCA1,并探讨了它影响胃癌细胞多种表型变化的分子机制,发现UCA1能够通过调控CDKN1B和CDC25B改变细胞周期分布从而影响细胞增殖;它还通过结合mi R-143调控HK2表达影响胃癌细胞糖代谢过程。此外,UCA1能够调控TP53和p-AKT表达影响胃癌细胞增殖和转移。总之,本研究为胃癌的治疗提供了潜在的新靶点。
【关键词】：长链非编码RNA 胃癌 UCA1 细胞增殖 肿瘤转移
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 1 主要内容与技术路线13-15
• 1.1 主要内容13-14
• 1.1.1 胃癌表达谱芯片分析和生物信息学筛选13
• 1.1.2 分析UCA1基因组变异和与临床病理因素的关系13
• 1.1.3 分析UCA1在胃癌细胞株中的表达水平及其亚细胞定位13
• 1.1.4 siRNA下调UCA1表达对胃癌细胞生物学功能的影响13
• 1.1.5 慢病毒稳定下调UCA1表达对胃癌细胞表型的影响13
• 1.1.6 探讨UCA1影响胃癌细胞功能的可能机制13-14
• 1.2 技术路线14-15
• 2 材料和方法15-26
• 2.1 实验材料15-16
• 2.1.1 主要仪器15
• 2.1.2 主要试剂15-16
• 2.2 实验方法16-26
• 2.2.1 胃癌lncRNA芯片分析和生物信息学筛选lncRNA16
• 2.2.2 公共数据验证UCA1在胃癌组织中的表达情况16-17
• 2.2.3 lncRNA的编码潜能分析17
• 2.2.4 细胞培养17
• 2.2.5 细胞RNA提取及定量17
• 2.2.6 实时定量RT-PCR检测RNA表达水平17-19
• 2.2.7 RNA荧光原位杂交实验19
• 2.2.8 siRNA干扰设计及转染19-20
• 2.2.9 MTT检测细胞增殖实验20
• 2.2.10 流式细胞术检测细胞周期和凋亡20-21
• 2.2.11 RNA干扰慢病毒构建及细胞感染21
• 2.2.12 细胞病毒感染21-22
• 2.2.13 细胞增殖实验22
• 2.2.14 细胞迁移实验22-23
• 2.2.15 Transwell实验分析细胞转移实验23
• 2.2.16 Western Blot23
• 2.2.17 质谱技术23-25
• 2.2.18 统计分析25-26
• 3 实验结果26-40
• 3.1 胃癌相关lncRNA芯片分析及生物信息学筛选26-27
• 3.2 UCA1在胃癌组织中表达水平的验证及其基因组变异分析27-30
• 3.3 UCA1的表达水平与胃癌临床病理因素分析30
• 3.4 UCA1在胃癌细胞株中表达水平检测及其亚细胞定位分析30-31
• 3.5 UCA1功能的初步验证31-34
• 3.6 慢病毒稳定下调UCA1明显抑制AGS细胞增殖、迁移和转移34-37
• 3.7 UCA1影响AGS细胞多种表型的分子机制的初步探讨37-40
• 4 讨论40-42
• 5 总结42-43
• 参考文献43-47
• 附录A 数据库链接和缩略词表47-49
• 附录B 综述49-68
• 参考文献63-68
• 在学研究成果68-69
• 致谢69

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本文编号：487787