肝癌HepG2细胞CYP2E1基因稳定高表达系的构建

发布时间：2017-06-27 22:19

  本文关键词：肝癌HepG2细胞CYP2E1基因稳定高表达系的构建，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:细胞色素P450E1(CYP2E1)不仅参与药物代谢,还可以催化多种外源性物质,形成最终的致癌活性物[1]。不仅如此,我们的研究[2-3]还发现CYP2E1可以通过代谢网络(如经典的CYP2E1-ROS/RNSM1HM/Nos2通路),即凭借其复杂代谢过程中的底物与产物参与基因表达的调控,从而更加深刻的影响细胞的各种功能。肿瘤发生前后,CYP2E1的差异性表达可能在肿瘤的维持、演进、转移中发挥作用。尤其是在CYP2E1高表达、易诱导的肝脏。对CYP2E1的研究有助于阐明其在肝癌的作用和寻找新的治疗靶点。本研究旨在通过慢病毒载体构建CYP2E1基因持续稳定高表达的HepG2细胞系,为下一步研究CYP2E1在肝癌发生发展中的作用及分子机制奠定基础。目的:获取完整CYP2E1基因,构建逆转录慢病毒Lenti-Cyp2e1-eG FP-Puro。通过感染HepG2细胞建立稳定高表达CYP2E1的肝癌细胞系。为深入研究CYP2E1在肝癌发生发展中的作用及分子机制提供理想的细胞模型。方法:通过PCR扩增,电泳分离后切胶回收,获取完整CYP2E1基因。经Invitrogen测序,比对UCSC中CYP2E1的编码序列,确保携带相应酶切位点的CYP2E1准确完整。构建载体质粒pLV(Exp)-Puro-CMVmCYP2E1。将载体质粒,包装质粒(pMDLg/pRRE、pRSV-REV)经E.col i DH5α扩增后,共同转染293T细胞制取慢病毒。利用携带CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-Cyp2e1-eGFP-Puro)感染HepG2。采用嘌呤霉素抗性筛选方法分离高表达CYP2E1肝癌HepG2细胞。通过增强绿色荧光蛋白检测转染情况,q-PCR及Western blotting检测HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系中CYP2E1 mRNA和蛋白的表达情况。结果:经Invitrogen测序与UCSC序列配比率为100%。通过含慢病毒培养基转染,Hep G2细胞系可在12h后表达e GFP荧光蛋白。空载组与高表达组感染效率基本相同。eGFP荧光蛋白率在24h后快速升高,在第4d达到90%,第6d接近100%表达。液氮冻存3个月后复苏该细胞,HepG2-CYP2E1荧光强度有所减弱,但表达率仍接近100%。转染CYP2E1基因的HepG2细胞系高表达CYP2E1 mRNA,为正常HepG2表达量的682.70±6.11倍(P0.05),正常HepG2与空载HepG2之间CYP2E1mRNA比较无统计学差异(0.22±0.06、0.36±0.05,P0.05)。正常Hep G2、空载细胞CYP2E1蛋白表达量比较差异无统计学意义(1.26±0.02、1.29±0.01,P0.05)。病毒转染的Hep G2细胞CYP2E1蛋白表达量(9.51±0.78)较空载及正常HepG2细胞系高(P均0.01)。结论:1、成功构建了表达CYP2E1基因的载体质粒。2、通过慢病毒转染建立高表达CYP2E1基因的HepG2细胞系。
【关键词】：CYP2E1基因 慢病毒载体 肝癌 HepG2细胞
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 致谢4-7
• 摘要7-9
• Abstract9-13
• 前言13-17
• 实验试剂、材料和仪器17-23
• 实验方法23-41
• 结果41-45
• 讨论45-49
• 结论49-50
• 参考文献50-53
• 综述：细胞色素P4502E1在肿瘤发生发展中的作用53-67
• 参考文献62-67
• 附录67-71
• 个人简历71-72

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本文编号：491480