稀有细胞的单细胞基因突变检测

发布时间：2017-06-28 15:11

  本文关键词：稀有细胞的单细胞基因突变检测，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血液内存在一些数量稀少却具有重要临床价值的稀有细胞,如循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、良性的循环上皮细胞、以及孕妇外周血中胎儿有核红细胞等,其中循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)因为可能提示了体内肿瘤的存在与复发风险,以及成为体内除原位病灶以外的肿瘤细胞的来源而成为了癌症研究的热点。目前绝大部分研究主要针对外周血中全体CTC进行计数以及基因突变分析,而忽略了CTC的异质性,尤其是CTC在遗传学上的异质性与功能上异质性的相互关系,因此必须发展针对单个CTC的基因检测技术。本文主要基于显微操作平台,用毛细玻璃管获取单个细胞,然后进行全基因组放大,从而扩增目的基因并检测突变。同时,我们根据单细胞尺度上功能蛋白与基因协同检测的需要,将单个细胞在芯片上裂解后先进行功能蛋白检测,然后抽取单个细胞的裂解产物进行基因检测。最后,我们将基于微流控芯片的外周血中CTC的捕获技术与单细胞基因突变检测相结合,对肺癌患者进行实际的临床样本检测。我们所发展的集成式微流控芯片系统能够高效分选出患者血液中的CTC,并通过红细胞与白细胞的负选芯片除去由于非特异性捕获而混在CTC中的血细胞,从而得到高纯度的CTC用于后续检测。
【关键词】：循环肿瘤细胞 微流控芯片 单细胞基因检测 EGFR
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.4
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章：绪论11-30
• 1.1 背景11-14
• 1.2 早期诊断14-16
• 1.3 肿瘤的转移和诊断16-18
• 1.3.1 肿瘤转移16-17
• 1.3.2 肿瘤诊断17-18
• 1.4 循环肿瘤细胞检测18-24
• 1.4.1 循环肿瘤细胞18-19
• 1.4.2 循环肿瘤细胞研究平台—Cell Search19-20
• 1.4.3 CTC捕获的快速发展20-24
• 1.4.3.1 基于单抗体的捕获20-21
• 1.4.3.2 上皮间质转化21-23
• 1.4.3.3 负性选择23-24
• 1.5 肺癌中的常见基因检测24-30
• 1.5.1 非小细胞肺癌（NSCLC）24
• 1.5.2 常见的基因突变检测24-29
• 1.5.2.1 KRAS25-27
• 1.5.2.2 EGFR27-29
• 1.5.3 主要研究基因29-30
• 第二章：单个肿瘤细胞的基因突变检测30-47
• 2.1 研究目的30
• 2.2 材料与方法30-47
• 2.2.1 实验材料30-35
• 2.2.1.1 细胞系30-31
• 2.2.1.2 实验试剂31-33
• 2.2.1.3 实验设备33-34
• 2.2.1.4 基因突变引物34-35
• 2.2.2 实验方法35-47
• 2.2.2.1 显微操作获取单细胞35-37
• 2.2.2.2 单细胞检测37-47
• 2.2.2.2.1 少量细胞（10个）基因组DNA放大37-44
• 2.2.2.2.2 检测方法的灵敏度44-46
• 2.2.2.2.3 悬浮状态的单细胞基因检测46
• 2.2.2.2.4 微操获取经固定的单个细胞46-47
• 第三章：单个肿瘤细胞核的基因突变检测47-66
• 3.1 细胞裂解产物的基因检测47-51
• 3.1.1 A549的实验结果47-48
• 3.1.2 NCI-H1650的实验结果48-49
• 3.1.3 NCI-H1975的实验结果49-51
• 3.2 芯片内单个细胞核的基因检测51-60
• 3.2.1 微流控芯片设计52-53
• 3.2.2 显微操作取微芯片中裂解后的细胞核53-56
• 3.2.2.1 无修饰操作53
• 3.2.2.2 BSA修饰微芯片后的显微操作53-54
• 3.2.2.3 双重修饰后操作54-55
• 3.2.2.4 优化55-56
• 3.2.3 芯片内单个细胞核的基因检测56-60
• 3.3 临床患者单个循环肿瘤细胞的基因检测60-66
• 第四章：肿瘤细胞的分选66-76
• 4.1 鱼骨型芯片中负载DNA的验证67
• 4.2 同质性CTC捕获理论67-68
• 4.3 CTC捕获的模拟68-70
• 4.4 临床样本检测70-71
• 4.5 CTC的释放71-73
• 4.6 CTC的纯化73-74
• 4.7 分离具有特定表型的CTC子群74-76
• 第五章：结论76-78
• 5.1 研究结论76-77
• 5.2 研究展望77-78
• 参考文献78-84
• 致谢84-86
• 攻读硕士学位期间发表的学术成果86

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