BTG2对膀胱癌细胞EJ生物学特性的影响
发布时间：2017-06-29 10:17
本文关键词：BTG2对膀胱癌细胞EJ生物学特性的影响，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的：为了研究抗增殖蛋白BTG2 (B cell translocation gene 2,BTG2)在膀胱癌发生发展中的作用,本课题首先采用RT-PCR的方法测定不同膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、5637、T24及正常的人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中BTG2的表达,分析人膀胱上皮永生化细胞中BTG2的表达与膀胱癌细胞中表达的差异。构建人BTG2真核表达载体pcDNA3. 1(+)-BTG2,筛选并鉴定膀胱癌EJ细胞稳定转染细胞株,观察BTG2对膀胱癌细胞EJ形态、生长、克隆形成、迁移的影响,在细胞水平初步探讨BTG2在膀胱癌发生发展中的作用,为未来膀胱癌基因治疗提供理论依据。方法：比较BTG2在不同膀胱癌细胞株中的表达：用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养膀胱癌细胞EJ、BIU-87、T24、5637,用含10%胎牛血清的F12K培养基培养人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,用TRIzol提取细胞总RNA后利用RT-PCR的方法测定不同细胞中BTG2的表达,分析膀胱癌细胞中BTG2的表达量与人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中表达量的不同,判断细胞中BTG2表达是否在正常细胞与肿瘤细胞中存在显著性差异,阐明BTG2基因是否参与膀胱癌的发生和进展。构建了BTG2真核表达载体,并建立了膀胱癌EJ细胞稳定转染细胞株。首先根据人BTG2基因序列设计合适的引物,用PCR法得到BTG2片段,插入带有真核细胞筛选标记的pcDNA3.1(+)载体,构建真核生物载体pcDNA3.1(+)-BTG2表达载体。采用限制性内切酶及DNA测序对重组体进行鉴定,证实载体构建准确无误。然后将BTG2表达质粒转染人膀胱癌细胞EJ,G418(400 mg/L)筛选出抗性克隆,扩增后筛选出单克隆稳定转染细胞株。用G418(200 mg/L)维持培养稳定转染细胞株,提取细胞总RNA(TRIzol),通过荧光定量PCR和半定量RT-PCR分析检测稳定转染细胞中BTG2基因的表达,证实BTG2在膀胱癌EJ细胞中有效表达,最终成功建立了过表达BTG2的膀胱癌稳定转染细胞株。BTG2对膀胱癌细胞EJ生物学特性的影响：倒置显微镜下观察BTG2对膀胱癌细胞EJ形态和数量的影响；应用细胞生长曲线法研究BTG2抗细胞增殖的作用；克隆形成实验计算克隆形成率,研究BTG2对膀胱癌细胞EJ增殖能力的影响；利用划痕实验观察BTG2对膀胱癌细胞EJ运动能力的影响。结果：利用实时荧光定量PCR法测定不同膀胱癌细胞及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中BTG2 mRNA的量,数据显示：人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中BTG2的表达明显高于其他膀胱癌细胞EJ.BIU-87、T24、5637,而且在其余的膀胱肿瘤细胞中恶性度最高的T24细胞中BTG2的表达量最低,而细胞EJ和BIU-87则相近,恶性度较低的细胞5637中表达最高,据此发现膀胱癌恶性度越高BTG2的表达越低,可以推测BTG2在膀胱癌的发生发展中起抑癌作用。将构建的pcDNA3.1(+)-BTG2表达质粒转染到膀胱癌细胞EJ中,构建稳定转染细胞株。观察到稳定转染细胞B2C6较转染空载体组E2C5细胞生长缓慢,细胞变宽,形态不规则,利用生长曲线法测定BTG2对膀胱癌细胞EJ增殖的影响,转染了BTG2的细胞较转染空载体pc-DNA3.1(+)组及其未处理细胞EJ组细胞生长明显受到抑制。另外也发现转染BTG2表达质粒后细胞的生存能力受到显著抑制,细胞克隆实验中观察到转染了BTG2的真核表达载体后细胞克隆明显比转染空载体和未处理组细胞克隆形成低并且克隆较小。此外,为了了解BTG2对膀胱癌细胞EJ运动能力的影响,划痕实验的研究中发现转染BTG2质粒载体后膀胱癌细胞EJ的运动能力较未转染组和转染空载体组低,随着时间的推移观察到划痕的面积缩小的程度较未处理组和转染空载体组小,提示BTG2基因可以抑制膀胱癌细胞EJ的迁移,细胞迁移率明显减小。结论：这些研究结果说明,BTG2在膀胱癌细胞中的表达远较人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1降低,提示BTG2的表达降低可能参与了膀胱癌的发生与发展,且BTG2能够抑制膀胱癌细胞EJ的增殖能力并且减弱其迁移能力,可能在膀胱肿瘤中发挥抑癌基因的活性,为膀胱癌的诊断和治疗提供了理论依据。
【关键词】：膀胱癌 B细胞异位基因2 抗增殖 基因治疗
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14
【目录】：
- 中文摘要3-5
- 英文摘要5-7
- 缩略词表7-10
- 第一章 前言10-14
- 第二章 材料与方法14-26
- 2.1 主要材料与试剂14
- 2.2 主要溶液配制14-15
- 2.3 主要仪器15-16
- 2.4 细胞培养与处理16
- 2.4.1 细胞培养与传代16
- 2.5 RT-PCR检测不同膀胱癌细胞中BTG2的表达16-18
- 2.5.1 不同膀化癌细胞（EJ、T24、BIU-87、5的7)及人膀r郎掀び郎赴，
本文编号：497521
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