PURA和RIP3与食管癌发生发展相关性研究

发布时间：2017-06-29 17:01

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【摘要】：食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我国食管癌的主要病理类型。其易发生淋巴结转移,预后较差。细胞凋亡是多细胞生物重要的细胞死亡方式之一,细胞凋亡受阻与肿瘤发生发展密切相关。Caspase-8是半胱氨酸蛋白酶家族的一员,能在外源凋亡信号诱导下被募集形成死亡诱导信号复合物(Death-inducing signaling complex, DISC),进一步活化后启动细胞凋亡。Caspase-8剪切异构体Caspase-8L由于其缺乏C末端催化结构域而保留了完整的N末端死亡效应结构域,在Jurkat等细胞中能竞争性与DISC结合而抑制细胞凋亡。富含嘌呤元件结合蛋白a (Purine-rich element binding protein alpha, PURa)通过直接或间接与DNA结合,调控细胞DNA损伤修复和多种肿瘤相关基因的表达；通过与RNA结合而调控RNA的转运。本研究建立了稳定过表达PURα的食管癌细胞KYSE510-PURα和对照细胞KYSE 510-pCMV6,探讨PURα过表达对食管癌细胞Caspase-8/Caspase-8L等基因表达及其功能的影响。发现过表达PURα促进Caspase-8 L的表达和胞浆定位,而抑制Caspase-8的活化。相反,抑制食管癌细胞PURa表达会促进Caspase-8的活化。Caspase-8L的高表达和胞浆转位抑制Caspase-8酶活性。侵袭和转移是与食管癌预后差密切相关的原因,上皮间叶转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤细胞获得迁移能力的重要生物学特性。对食管癌细胞如何获得EMT表型,进而促进细胞侵袭转移的分子机理知之甚少。通过对稳定过表达PURα的食管癌细胞KYSE 510-PURa及其对照细胞KYSE510-pCMV6的转录组分析,发现多种与细胞粘附相关分子的转录发生明显改变。同时,过表达PURα的食管癌细胞形态呈现纤维样改变。蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光分析发现,过表达PURα的食管癌细胞中E-cadherin表达减少,而N-cadherin、 Vimentin和Snail表达升高。细胞增殖速度加快,细胞运动与侵袭以及划痕愈合能力显著增加,呈现典型的EMT样改变。同时,在宫颈癌HeLa细胞中过表达PURα,也观察到细胞发生同样的EMT表型改变。进一步,对181例食管癌和癌旁组织的免疫组化分析,结果表明食管癌组织中PURα表达显著升高(p0.001)。PURα表达增高诱导ESCC等肿瘤细胞发生EMT样改变,细胞生长、运动和侵袭迁移能力增强。肿瘤细胞过表达PURα是导致食管癌侵袭转移的重要原因之一。顺铂是食管癌治疗的主要化疗药物之一,能通过与DNA碱基发生交联,抑制肿瘤细胞的DNA复制过程而引起肿瘤细胞死亡。受体相互作用蛋白激酶3 (Receptor interacting protein kinase 3, RIP3)在细胞死亡过程中发挥重要的作用。前期实验发现在食管癌KYSE 140细胞中稳定敲降RIP3后,细胞对顺铂的敏感性降低。定量蛋白质组分析提示RIP3通过DNA损伤修复通路影响食管癌细胞对顺铂的敏感性。然而,RIP3影响细胞对顺铂敏感性的分子机制尚不十分清楚。本研究发现在食管癌KYSE 140细胞中瞬时敲降RIP3,细胞对顺铂的敏感性降低。相反,在食管癌KYSE 140和KYSE510细胞,以及小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryo fibroblast, MEF)过表达RIP3后,增加了细胞对顺铂的敏感性。进一步,通过成簇规律间隔的短回文重复/CRISPR相关基因9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated gene 9, CRISPR/Cas9)技术,在人胚肾HEK293T细胞中构建了RIP3基因稳定敲除细胞HEK293T-RIP3KO。进而在RIP3缺失细胞中重新表达野生型或激酶结构域突变RIP3后,发现过表达野生型和激酶结构域突变的RIP3均增强了细胞对顺铂的敏感性,而且这一功能不依赖于RIP3的激酶活性。蛋白免疫印迹结果显示,在敲除RIP3的HEK293T-RIP3KO细胞中过表达RIP3后,细胞DNA损伤修复通路中CDC37、c-JUN、FOSL1、POLD1、和磷酸化JNK、ERK和AKT等关键分子的表达发生明显改变。RIP3通过影响细胞DNA损伤修复通路而维持细胞对顺铂的敏感性。推测RIP3可能参与DNA错配修复(Mismatch repair, MMR),通过介导DNA损伤应答和诱导细胞凋亡而维持生物体基因组稳定性。DNA错配修复缺陷会使整个基因组不稳定,最终导致肿瘤发生。因此,RIP3有可能作为一种潜在的药物靶标,影响肿瘤细胞对顺铂治疗的敏感性。
【关键词】：食管鳞状细胞癌 PURα Caspase-8 酶活性 上皮间叶转化 RIP3 顺铂
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 缩略语索引表8-10
• 摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 引言14-16
• 第一部分 PURα促进食管癌细胞Caspase-8L的抗凋亡功能16-41
• 摘要16-17
• Abstract17-19
• 引言19-22
• 材料和方法22-32
• 一、材料22-25
• 1. 细胞系22
• 2. 菌株与质粒22
• 3. 抗体22
• 4. 主要仪器22-23
• 5. 主要试剂23-24
• 6. 常用溶液的配制24-25
• 二、方法25-32
• 1. 细胞培养25-26
• 2. 细胞全蛋白提取26
• 3. Bradford法蛋白定量26
• 4. Western blot analysis26-27
• 5. 免疫荧光27-28
• 6. 质粒的扩增和提取28-29
• 7. 稳定转染细胞系筛选29-30
• 8. Caspase-8蛋白酶活检测30-32
• 结果32-36
• 1. PURα过表达食管癌细胞构建32-33
• 1.1 PURα在不同食管癌细胞中的表达32
• 1.2 PURα过表达载体构建32
• 1.3 PURα过表达细胞系筛选32-33
• 2. PURα过表达抑制细胞凋亡33-36
• 2.1 PURα过表达上调食管癌细胞Caspase-8L表达33-34
• 2.2 PURα过表达促进食管癌细胞Caspase-8L胞浆转位34
• 2.3 Caspase-8L胞浆定位抑制外源凋亡通路的活化和促进细胞存活34-36
• 讨论36-40
• 小结40-41
• 第二部分 PURα过表达引起食管癌细胞EMT41-70
• 摘要41-42
• Abstract42-43
• 前言43-44
• 材料和方法44-46
• 一、材料44
• 1. 抗体44
• 2. 试剂44
• 二、方法44-46
• 1. 免疫组织化学44-45
• 2. WST-8法检测细胞生长45
• 3. 细胞Transwell侵袭实验45
• 4. 细胞划痕实验和划痕创伤愈合修复分析45-46
• 结果46-60
• 1. PURα在食管癌和癌旁食管上皮中的表达46-47
• 2. KYSE 510-PURα和KYSE 510-pCMV6细胞转录组分析47-53
• 4. 过表达PURα的KYSE 510细胞形态的检测53-55
• 5. 过表达PURα对KYSE 510细胞生长影响55
• 6. E-cadherin和Vimentin在KYSE 510-PURα细胞中的表达55-56
• 7. EMT相关蛋白在PURα过表达细胞中的表达56-58
• 8. KYSE 510-PURα细胞迁移能力的分析58
• 9. KYSE 510-PURα细胞侵袭能力的分析58-60
• 讨论60-69
• 小结69-70
• 第三部分 RIP3过表达增强食管癌细胞对顺铂的敏感性70-92
• 摘要70-71
• Abstract71-72
• 前言72-73
• 材料和方法73-77
• 一、材料73-74
• 1. 细胞系73
• 2. 抗体73
• 3. 菌株与质粒73
• 4. siRNA73-74
• 二、方法74-77
• 1. 细胞培养74
• 2. 细胞转染74
• 3. WST-8法检测细胞存活率74-75
• 4. 顺铂处理细胞75
• 5. 在HEK293T细胞RIP3基因的CRISPR/Cas9稳定敲除75-77
• 结果77-82
• 1. KYSE 140细胞敲降RIP3对顺铂敏感性的影响77
• 2. KYSE 140细胞过表达RIP3对顺铂敏感性的影响77-78
• 3. KYSE 510细胞过表达RIP3对顺铂敏感性的影响78
• 4. MEF细胞过表达RIP3对顺铂敏感性的影响78-79
• 5. HEK293T细胞敲除RIP3基因79-80
• 6. HEK293T-RIP3KO细胞过表达RIP3对顺铂敏感性的影响80
• 7. 过表达RIP3对HEK293T-RIP3KO细胞DNA损伤修复通路影响80-82
• 讨论82-91
• 小结91-92
• 参考文献92-99
• 文献综述99-112
• 参考文献109-112
• 个人简历112-114
• 致谢114-115
• 附件：研究生期间获奖证书和发表文章115-137

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1 郭志敏;PURA和RIP3与食管癌发生发展相关性研究[D];北京协和医学院;2015年

  本文关键词：PURA和RIP3与食管癌发生发展相关性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：498593