LAT在T系白血病裸鼠CD59介导的T细胞活化信号转导中的作用研究

发布时间：2017-06-30 07:18

  本文关键词：LAT在T系白血病裸鼠CD59介导的T细胞活化信号转导中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:利用T系Jurkat白血病细胞建立裸鼠动物模型,对其进行生物学鉴定,研究T细胞活化衔接蛋白(LAT)及其棕榈酰化,在CD59分子介导T淋巴细胞活化信号转导中的作用。方法:体外培养人Jurkat细胞,构建LAT-EGFP(LAT分子高表达)、LAT-M-EGFP(LAT分子棕榈酰化位点突变)的慢病毒载体,转染入Jurkat细胞,从而建立稳定表达目的基因的细胞株。BALB/C纯系雌性裸鼠24只,编号后随机抽取,分为空白对照组1组,以及实验组3组:LAT组、LAT-M组和正常Jurkat组,每组6只。第一、第二天通过腹腔注射定量的环磷酰胺,第三天用尾静脉注射的方法,实验组小鼠分别接种Jurkat细胞株5×106个/只,空白对照组小鼠则尾静脉注射等量无菌PBS溶液,注射定时定量,连续两天。观察小鼠发病一般体征,分别于移植后第1周(7d)、第2周(14d)、第3周(21d)、第4周(28d)监测体质量及外周血白细胞数量变化;并用ELISA检测模型小鼠外周血中IL-2表达水平;取肝脾组织进行HE染色观察;流式细胞术(FCM)检测骨髓白血病细胞增殖率;免疫组化染色法检测肝组织中细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Caspase-3的表达水平;血涂片于激光共聚焦显微镜下观察CD59单克隆抗体活化前后LAT在细胞膜上的定位。结果:静脉移植Jurkat细胞后,实验组小鼠逐渐出现病态体征,表现为嗜睡、食欲减退、体质量减轻、精神萎靡、弓背、后肢瘫痪等症状,外周血WBC计数呈增高趋势,生存时间较对照组明显缩短,肝脾组织HE染色及骨髓涂片光镜下观察均可见肿瘤细胞浸润,建模成功,对照组小鼠活力正常均存活。实验组中LAT组小鼠第四周即出现濒死状态,伴脊柱侧弯,呈恶病质,WBC计数高于其他各组。ELISA检测结果示LAT组血清中IL-2表达水平高于LAT-M组和Jurkat组。促凋亡因子Caspase-3在LAT-M组中的表达高于LAT组和Jurkat组,促进细胞活化的Bcl-2蛋白,在LAT组中的表达高于LAT-M组和Jurkat组,且LAT-M组表达水平低于Jurkat组。流式细胞术检测到LAT组白血病细胞增殖率高于LAT-M组和Jurkat组。通过激光共聚焦显微镜观察LAT组提示,于细胞膜上可见LAT分布且点簇状聚集于脂筏,经CD59单抗交联后,点簇状聚集较刺激前更为明显;而在LAT-M组中,可见LAT分子散在分布,未见点簇状聚集,CD59抗体作用后无明显变化。结论:成功建立T系Jurkat白血病细胞裸鼠动物模型。从体内实验证实LAT分子及其棕榈酰化在T细胞活化信号转导中的正向激活作用;CD59分子通过向LAT提供棕榈酰基团,进而共同定位于脂筏,介导T细胞的信号转导。
【关键词】：T淋巴细胞 裸鼠模型 LAT棕榈酰化 CD59
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 技术路线9-10
• 第一章 材料与方法10-20
• 1.1 材料10-11
• 1.1.1 主要实验仪器10
• 1.1.2 病毒与细胞株10
• 1.1.3 实验动物10-11
• 1.1.4 主要实验试剂11
• 1.2 方法11-20
• 1.2.1 Jurkat细胞的培养11-12
• 1.2.2 慢病毒载体转染Jurkat细胞12-13
• 1.2.3 建立Jurkat细胞裸鼠动物模型13-14
• 1.2.4 动物模型各项指标检测14-19
• 1.2.4.1 ELISA检测外周血IL-2 表达水平14-16
• 1.2.4.2 骨髓涂片免疫荧光16
• 1.2.4.3 肝脾组织苏木精-伊红（HE）染色16-17
• 1.2.4.4 免疫组化法检测Caspase-3、Bcl-2 的表达17-18
• 1.2.4.5 流式细胞术（FCM）检测骨髓中肿瘤细胞18
• 1.2.4.6 激光共聚焦显微镜观察LAT分子定位18-19
• 1.2.5 统计学分析19-20
• 第二章 实验结果20-32
• 2.1 细胞的培养慢病毒转染后的Jurkat细胞20-21
• 2.2 建模后小鼠发病一般状况21-24
• 2.2.1 体质量及生存时间21-22
• 2.2.2 外周血白细胞计数22-24
• 2.3 骨髓涂片免疫荧光24-25
• 2.4 肝脾组织HE染色25-26
• 2.5 免疫组化检测肝组织中Caspase-3、Bcl-2 的表达26-27
• 2.6 流式细胞术检测骨髓中阳性肿瘤细胞27-29
• 2.7 ELISA检测血清IL-2 表达29-30
• 2.8 激光共聚焦显微镜观察LAT分子定位30-32
• 第三章 讨论32-35
• 结论35-36
• 参考文献36-38
• 综述38-49
• 综述参考文献45-49
• 攻读学位期间的研究成果49-50
• 附录50-52
• 致谢52-53

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