非小细胞肺癌细胞株中eEF2K与细胞自噬和死亡关系的研究

发布时间：2017-07-03 17:05

  本文关键词：非小细胞肺癌细胞株中eEF2K与细胞自噬和死亡关系的研究

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【摘要】：真核延伸因子2激酶(eEF2K)是一种Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶,eEF2是其已知的唯一底物。eEF2K催化eEF2的Thr56位点发生磷酸化,导致降低eEF2与核糖体的结合能力进而抑制肽链延伸。通过近几年的研究发现,许多类型的癌细胞中均呈现eEF2K高表达或高度活化,尤其是在胶质瘤、乳腺癌中最为明显。eEF2K表达水平或者活性的改变还将影响细胞的许多生理进程,例如,细胞周期、细胞分化、细胞凋亡以及自噬等。其中eEF2K活性水平的改变与细胞自噬进程的调控又是其中的热点,在胶质瘤细胞系和乳腺癌细胞系中发现eEF2K活性增强能够诱导自噬,抑制eEF2K活性诱导的自噬能够增加多种药物的有效性。到目前为止对非小细胞肺癌细胞株中eEF2K的研究还基本处于空白阶段。吉非替尼为为EGFR酪氨酸激酶抑制剂的代表药物,也是临床上常用的治疗非小细胞肺癌的药物,但是随着作用时间的延长会逐渐出现耐药,限制了吉非替尼的应用。本课题目的：旨在观察在非小细胞肺癌中eEF2K是否与细胞自噬和死亡存在联系并研究eEF2K是否参与吉非替尼的耐药,为将来eEF2K作为抗肿瘤靶标提供更加充实的证据。第一部分非小细胞肺癌细胞株中吉非替尼诱导eEF2K活化与细胞自噬在本部分实验中采用吉非替尼处理非小细胞肺癌发现,吉非替尼能够显著增强非小细胞肺癌株H1975和A549中eEF2K的活性且具有一定的时间和剂量依赖性。通过免疫沉淀对自噬相关蛋白LC3和P62检测、免疫荧光检测自噬体颗粒状的形成以及通过透射电镜对自噬体形成的检测,发现吉非替尼能够导致非小细胞肺癌中自噬活性且具有时间和剂量依赖性。而且还发现由吉非替尼引起的eEF2K活性增加以及自噬活性增强在时间和浓度上存在一致性,表明两者可能存在某种联系。第二部分非小细胞肺癌细胞株中eEF2K与细胞自噬和死亡关系的研究1、抑制eEF2K舌性或干扰其表达后对由吉非替尼引发自噬的影响通过贫血清方法测定A484954在非小细胞肺癌中抑制eEF2K最适作用浓度100uM以及最适作用时间为6h,然后通过采用eEF2K小分子抑制剂以及加入其干扰片段抑制eEF2K的活性或者表达后,发现对由吉非替尼引起的自噬没有影响。并且通过对同样能够引起非小细胞肺癌株中eEF2K活性升高以及白噬活性增强的化合物Stattic试验,也得出同样的结论。2、吉非替尼引起的自噬和eEF2K活性对细胞生存的影响eEF2K的抑制并不能对由吉非替尼引起的自噬产生影响,接下来分别对由吉非替尼引起的eEF2K舌性升高、自噬活性增强及细胞生存能力情况三者进行探讨。发现在非小细胞肺癌株中通过3-MA抑制自噬的活性能够明显增强吉非替尼的药效,而通过A484954抑制eEF2K活性或者干扰其表达后在吉非替尼处于高浓度的情况下能够降低吉非替尼的药效,使得细胞生存能力增强且这种增强作用在提前将eEF2K舌性抑制后效果更为明显。3、eEF2K在非小细胞肺癌细胞株中的作用及作用机制初探在无吉非替尼作用下,通过A549细胞干扰eEF2K后细胞计数和平板克隆发现eEF2K被抑制以后能够导致细胞生存能力的增加,并能够引起自噬活性的增强。而在乳腺癌细胞中eEF2K被抑制可以减少自噬并抑制乳腺癌细胞生长。通过本研究我们初步明确了抑制eEF2K对吉非替尼引起的自噬无明显影响和导致细胞存活增加的原因可能是在非小细胞肺癌中eEF2K自身可抑制细胞自噬与细胞增殖。意义：通过本课题研究确定了在非小细胞肺癌细胞株中eEF2K不参与吉非替尼介导的耐药并且还发现在非小细胞肺癌细胞株中抑制eEF2K还能够导致细胞自噬活性增强以及生存能力提高,表明eEF2K在不同肿瘤细胞中的作用存在差异,这为将来有针对性地应用和开发有效的靶向eEF2K的药物奠定了基础。
【关键词】：吉非替尼 eEF2K 自噬
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 前言12-19
• 1 eEF2K概述12-16
• 1.1 eEF2K的分子结构13
• 1.2 eEF2K的调控13-15
• 1.2.1 自身磷酸化对eEF2K活性的影响13-14
• 1.2.2 其他位点磷酸化对eEF2K活性的调控14-15
• 1.3 eEF2K一个潜在的抗肿瘤靶点15-16
• 1.3.1 抑制eEF2K增强药物的抗肿瘤活性15
• 1.3.2 eEF2K的抑制剂的研究进展15-16
• 2 细胞自噬16-17
• 3 吉非替尼与耐药17-19
• 第一部分 非小细胞肺癌中吉非替尼诱导eEF2K活化与自噬19-35
• 引言19
• 1 实验材料19-23
• 1.1 实验药品19
• 1.2 实验试剂19-20
• 1.3 耗材20
• 1.4 抗体20
• 1.5 仪器20-21
• 1.6 常用溶液配制方法21-23
• 1.7 细胞株和细胞23
• 2 实验方法23-28
• 2.1 测定吉非替尼处理后NSCLC中eEF2K活性23-25
• 2.1.1 测定吉非替尼处理后H1975和A549这两种NSCLC的细胞活力23-24
• 2.1.2 测定吉非替尼处理后H1975细胞中eEF2K活性24-25
• 2.1.3 测定吉非替尼处理后A549细胞中eEF2K活性25
• 2.2 测定吉非替尼处理后两种细胞中自噬活性25-28
• 2.2.1 测定吉非替尼处理后H1975细胞中自噬活性25-26
• 2.2.2 测定吉非替尼处理后A549细胞中自噬活性26-28
• 3 实验结果28-32
• 3.1 吉非替尼处理对非小细胞肺癌细胞eEF2K活性的影响28-30
• 3.1.1 吉非替尼对H1975和A549两种非小细胞肺癌细胞株的增殖抑制作用28
• 3.1.2 吉非替尼处理对H1975细胞中eEF2K活性的影响28-29
• 3.1.3 吉非替尼处理对A549细胞中eEF2K活性的影响29-30
• 3.2 吉非替尼处理对非小细胞肺癌细胞中自噬活性的影响30-32
• 3.2.1 吉非替尼处理对H1975细胞中自噬活性的影响30
• 3.2.2 吉非替尼处理对A549细胞中自噬活性的影响30-32
• 讨论32-35
• 第二部分 吉非替尼作用中eEF2K、自噬、细胞死亡三者关系研究35-62
• 引言35-36
• 1. 实验材料36-40
• 1.1 实验药品36
• 1.2 实验试剂36
• 1.3 耗材36-37
• 1.4 抗体37
• 1.5 仪器37
• 1.6 常用溶液配制方法37-40
• 1.7 细胞株和细胞40
• 2. 实验方法40-49
• 2.1 抑制eEF2K活性或干扰其表达后吉非替尼引起的自噬活性的测定40-44
• 2.1.1 确定A484954最适作用时间以及最适作用浓度40-42
• 2.1.2 检测A484954与吉非替尼联合作用后两种NSCLC细胞系中自噬活性42-43
• 2.1.3 将eEF2K干扰后检测由吉非替尼引起的NSCLC细胞自噬活性43-44
• 2.2 检测A484954与Stattic联合作用后两种NSCLC细胞系中自噬活性44
• 2.2.1 检测Stattic处理后H1975细胞中eEF2K活性以及自噬活性44
• 2.2.2 检测A484954和Stattic联合作用后两种NSCLC细胞系中自噬活性44
• 2.3 检测吉非替尼和A484954联合作用后NSCLC细胞系增殖能力44-47
• 2.3.1 检测两者同时作用后NSCLC细胞系增殖能力44-45
• 2.3.2 检测两者序贯给药后NSCLC细胞系增殖能力45
• 2.3.3 敲除eEF2K后给药检测NSCLC细胞系增殖能力45-47
• 2.4 抑制吉非替尼引起的自噬活性对NSCLC细胞系中凋亡水平的检测47
• 2.5 敲除eEF2K后检测NSCLC细胞系生存能力47-48
• 2.6 初步探讨eEF2K敲除后促进NSCLC细胞系生存能力的机制48-49
• 2.7 用乳腺癌细胞系MCF-7以及MDB-MB-231细胞对eEF2K敲除后对细胞自噬能力的影响进行验证49
• 3. 实验结果49-59
• 3.1 抑制eEF2K活性或干扰其表达对由吉非替尼引起自噬活性的影响49-53
• 3.1.1 确定A484954最适作用时间以及最适作用浓度49-51
• 3.1.2 A484954与吉非替尼联合作用对两种NSCLC细胞中eEF2K活性与自噬活性关系的影响51-52
• 3.1.3 通过SiRNA敲除eEF2K对由吉非替尼引起NSCLC细胞自噬活性的影响52-53
• 3.2 A484954与Stattic联合作用对两种NSCLC细胞系中eEF2K活性与自噬活性关系的影响53-54
• 3.2.1 Stattic作用于H1975细胞对eEF2K及自噬活性的影响53-54
• 3.2.2 A484954和Stattic联合作用对两种NSCLC细胞系中eEF2K活性与自噬的关系影响54
• 3.3 抑制吉非替尼引起的eEF2K活性对NSCLC细胞系生存能力的影响54-57
• 3.3.1 吉非替尼和A484954同时作用对NSCLC细胞系生存能力的影响54-55
• 3.3.2 两者序贯给药对NSCLC细胞系生存能力的影响55-56
• 3.3.3 干扰eEF2K后给药对NSCLC细胞系生存能力的影响56
• 3.3.4 吉非替尼引起的自噬活性保护NSCLC细胞系的作用56-57
• 3.4 eEF2K干扰对NSCLC细胞系生长与自噬的影响57-59
• 3.4.1 eEF2K干扰对NSCLC细胞系生长的影响57-58
• 3.4.2 干扰eEF2K后诱导NSCLC细胞自噬58
• 3.4.3 干扰eEF2K后对乳腺癌细胞自噬能力的影响58-59
• 3.4.4 eEF2K干扰对乳腺癌细胞生长的影响59
• 讨论59-62
• 参考文献62-66
• 致谢66-67
• 个人简历67
• 发表学术论文67

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1 王根柱;非小细胞肺癌细胞株中eEF2K与细胞自噬和死亡关系的研究[D];中国海洋大学;2015年

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