人脐带间充质干细胞促进前列腺癌PC3细胞增殖的研究

发布时间：2017-07-04 10:24

  本文关键词：人脐带间充质干细胞促进前列腺癌PC3细胞增殖的研究

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【摘要】：研究背景及目的:干细胞和肿瘤关系的研究是目前生物学领域里的研究热点之一。本课题在体外分离、培养、鉴定了人脐带间充质干细胞(UC-MSCs),研究了UC-MSCs对前列腺癌细胞系PC3增殖作用的影响和机理,具有一定的理论和实践意义。研究材料和方法:经过知情同意后,我们从吉林大学第二医院取得了脐带,通过组织块贴壁法分离得到UC-MSCs,以成骨诱导、成脂诱导等方法对其进行鉴定。在UC-MSCs与肿瘤间关系的研究实验中,我们主要使用了UC-MSCs条件培养液(CM)进行实验,并用对应的无血清培养液(DMEM/RAPI-1640)作为对照。首先以CM和对应培养液对8种不同种类的肿瘤细胞系细胞进行培养,由于CM对前列腺癌PC3细胞活力影响最为明显,我们选择PC3细胞作为实验对象,并进一步确定了CM对PC3细胞的促增殖作用。通过阅读文献,我们初步认为骨保护素(osteoprotegerin,OPG)可能是上述促增殖作用的关键因子之一。为了验证我们的假说,我们首先检测了UC-MSCs、PC3细胞与另外两种正常体细胞的OPG在m RNA水平的表达量,并做了OPG对8种肿瘤细胞系生长影响的浓度梯度曲线;同时采取了抑制OPG的方法:分别在CM和1640培养液培养条件下,加入不同浓度的OPG抗体,检测PC3细胞活力。在机制方面,我们研究了促增殖作用与p-Erk/Erk间的关系:分别在CM和1640培养液培养条件下,检测PC3细胞的p-Erk/Erk的表达;向培养液中加入MAPKK抑制剂(可抑制Erk1/2的激活),检测两种培养液培养条件下PC3细胞的活力。体外检测了PC3细胞存在的状态下,MSCs是否有趋向性运动。整个实验中主要用到了流式鉴定、细胞周期测定、免疫荧光、共培养、RT-PCR,MTT和Western Blot、transwell等方法。研究结果:在本课题研究中我们从脐带中成功分离得到细胞,并且鉴定确定所分离得到的细胞即为MSCs。对8种不同种类的肿瘤细胞进行筛选后,发现对比于对照组,CM培养条件下,前列腺癌PC3细胞活力提升了2.7倍(p0.05),而其他细胞的细胞活力则没有明显的改变。我们发现在m RNA水平,UC-MSCs的OPG表达量大约是其他细胞的2.7倍(p0.05),继而发现,参与筛选的8种肿瘤细胞中,外加OPG时,PC3细胞增殖了1.3倍(p0.05),而其他7种细胞则没有出现增殖的现象。在封闭了PC3细胞自身分泌的OPG后,外加OPG抗体还能进一步抑制CM对PC3细胞的促增殖作用,这表明CM中含有OPG促进PC3细胞的增殖。在初步探究促增殖机制时,发现CM培养的PC3细胞的p-Erk/Erk表达量明显高于对照组,加入MAPKK抑制剂后能阻止一部分促增殖作用,这可能表明促增殖作用中Erk1/2起一定作用。有PC3细胞存在的情况下,发生迁移运动的MSCs增多。研究结论:1初步确定人UC-MSCs可以通过分泌OPG促进PC3细胞增殖,且促增殖过程中,MAPK通路可能被激活。2体外,UC-MSCs趋向PC3细胞运动。
【关键词】：脐带间充质干细胞 前列腺癌PC3细胞 骨保护素 MAPK ERK
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-3
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 中英文缩略词表11-12
• 第1章 绪论12-24
• 1.1 干细胞简介12-14
• 1.2 间充质干细胞简介14-16
• 1.2.1 间充质干细胞优势及定义14-15
• 1.2.2 脐带间充质干细胞15-16
• 1.3 间充质干细胞治疗疾病的研究16-18
• 1.4 干细胞与恶性肿瘤18-20
• 1.4.1 恶性肿瘤的现状18-20
• 1.4.2 干细胞与肿瘤间关系的研究20
• 1.5 骨保护素20-22
• 1.5.1 骨保护素简介21
• 1.5.2 骨保护素与肿瘤21-22
• 1.6 MAPK通路22-24
• 第2章 脐带间充质干细胞的分离提取鉴定24-37
• 2.1 实验仪器和材料24-27
• 2.1.1 主要仪器24-25
• 2.1.2 主要试剂和耗材25-26
• 2.1.3 主要试剂配制26-27
• 2.1.4 细胞来源27
• 2.2 实验方法27-31
• 2.2.1 脐带间充质干细胞的分离提取27-28
• 2.2.2 脐带间充质干细胞的传代、冻存、复苏28
• 2.2.3 脐带组织块的传代28-29
• 2.2.4 成骨诱导及染色鉴定干细胞29
• 2.2.5 成脂诱导及染色鉴定干细胞29
• 2.2.6 免疫荧光鉴定干细胞29-30
• 2.2.7 流式检测鉴定干细胞30-31
• 2.3 数据处理31
• 2.4 实验结果31-35
• 2.4.1 脐带间充质干细胞的分离提取31-32
• 2.4.2 脐带间充质干细胞的鉴定32-35
• 2.5 讨论35-37
• 第3章 脐带间充质干细胞分泌骨保护素（OPG）促进前列腺癌PC3细胞增殖37-58
• 3.1 实验仪器和材料37-39
• 3.1.1 主要仪器37
• 3.1.2 主要试剂和耗材37-38
• 3.1.3 主要试剂配制38-39
• 3.1.4 细胞来源39
• 3.2 实验方法39-47
• 3.2.1 条件培养液（CM）的获得39
• 3.2.2 MTT法测细胞活力39-40
• 3.2.3 免疫荧光40
• 3.2.4 细胞周期测定40
• 3.2.5 共培养实验40
• 3.2.6 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）40-43
• 3.2.7 Western Blot43-46
• 3.2.8 Transwell实验46-47
• 3.3 数据处理47
• 3.4 实验结果47-55
• 3.4.1 脐带间充质干细胞能特异性的促进前列腺癌PC3细胞增殖。47-48
• 3.4.2 确定脐带间充质干细胞条件培养液对PC3细胞的促增殖作用48-51
• 3.4.3 寻找对促增殖可能起关键作用的细胞因子并确定其作用51-53
• 3.4.4 探究条件培养液的促增殖作用与MAPK通路的关系53-55
• 3.5 讨论55-58
• 第4章 结论58-59
• 参考文献59-62
• 个人简介62-63
• 致谢63

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